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植物在长期进化过程中,为了适应环境形成了光呼吸代谢途径。虽然光呼吸降低了卡尔文循环的效率,光呼吸是所有光合有机体必不可少的,尤其是在CO2供应受限时,光呼吸为卡尔文循环提供了底物。光呼吸是一种重要的光保护机制,它可以清除光合作用电子传递链中多余的ATP和NADPH,维持叶绿体中能量吸收与利用之间的平衡,有效的避免了光抑制的发生。光呼吸途径在过氧化物酶体中产生H2O2,H2O2在植物体内具有双重效应,既可作为细胞氧化还原信号,同时又具有细胞毒性,会触发细胞程序性死亡。本实验利用OsCATAi转基因水稻分析了OsCATA基因在光呼吸过程中的功能;通过不同浓度的CO2和O2处理,分析光呼吸、卡尔文循环、光系统和抗氧化系统之间的关系。此外,利用酵母双杂交技术筛选水稻两周龄叶片cDNA文库,获得了部分可能与CATA相互作用的蛋白。主要研究结果如下: 1、通过定量PCR,Western blot及酶活性测定等对日本晴,转空载体水稻和OsCATAi转基因水稻两个株系进行鉴定和分析,定量PCR结果显示水稻OsCATA基因表达分别下降到原来的28%和15%,Western blot分析表明OsCATA蛋白表达显著降低到检测不出,CAT活性显著下降到只有对照的7%和6%。同时OsCATC基因表达显著增加到日本晴的7.50倍和8.16倍。H2O2组织化学检测结果显示,OsCATAi转基因水稻叶片中H2O2含量增加。 2、不同浓度CO2和O2处理下日本晴和OsCATAi转基因水稻的数字基因表达谱测序结果表明,与正常空气中日本晴相比,OsCATAi转基因水稻有1303个基因表达上调,391个基因表达下调,不同气体处理下上调基因和下调基因比例分别为:1053∶532(高CO2处理)、1799∶1037(高O2处理)、1777∶860(低O2处理)。与正常空气相比,日本晴在不同浓度CO2和O2处理下上调基因和下调基因比例分别为:451∶491(高CO2处理)、282∶397(低O2处理)、445∶564(高O2处理)。 3、与正常空气相比,日本晴在高CO2和低O2处理下表现相似,均表现为GLO活性、Rubisco初始活性和总活性降低,净光合速率与总光合速率下降,编码C3和C2途径相关酶基因OsFBA、OsRPK、OsRPI、OsrbcL、OsHPR和OsGDC均出现下调变化。光化学淬灭和稳态光合作用下量子产量值均下降。抗氧化酶活SOD、APX活性增加,GPX、CAT、GR、GST活性略有下降,抗氧化物质GSH、GSSG含量表现出下降变化。在高O2处理下,与正常空气中相比日本晴在生理和分子上的变化不大,略有上升;与高CO2处理相比,GLO活性、Rubisco初始活性和总活性、净光合速率和总光合速率、叶绿素荧光参数qP和Yield、抗氧化酶活和抗氧化物质含量基本表现为增加。 4、与日本晴和转空载体水稻相比,OsCATAi转基因水稻在不同浓度的CO2和O2处理下GLO活性、Rubisco初始活性和总活性、净光合速率和总光合速率显著降低,编码催化C3和C2途径相关酶基因下调明显。叶绿素荧光参数也均表现出下降变化。抗氧化酶活性和抗氧化物质含量均表现为增加,高O2处理下的变化相对于高CO2和低O2处理下虽有增加,但变化不显著。 5、构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-CATA,并验证pGBKT7-CATA在酵母细胞中没有毒性和自激活。然后,从水稻两周龄叶片cDNA文库中筛选与CATA互作蛋白,并初步筛选出13种蛋白。