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[目的]结肠癌(Colon cancer,CC)是常见的恶性肿瘤之一,早发现、早治疗可以提高患者的生存率。目前,早期结肠癌及癌前病变的检测主要是依赖白光内镜观察病变及活检后的病理定性,由于早期结肠癌内镜下的形态学特征不典型、病变分布不均一以及活检的局限性等原因,结肠癌早期诊断率低、漏诊率高的问题一直没有得到很好的解决。现有的早癌诊断模式存在不足,荧光内窥分子成像为我们提供了新的思路。本研究选择表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)为结肠癌的分子靶点,利用近红外荧光染料吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)标记西妥昔单抗(Cetuximab)构建近红外荧光分子探针ICG-Cetuximab,验证该探针在结肠癌荧光分子成像中的应用价值,为实现近红外荧光分子成像诊断早期结肠癌的临床转化提供了一定的理论基础。[方法]利用ICG中的琥珀酰亚胺基(NHS)与西妥昔单抗的氨基共价结合构建荧光探针ICG-Cetuximab。紫外可见分光光度计检测后计算探针的标记比率。Western Blot检测各结肠癌细胞株中EGFR表达情况,筛选出高表达EGFR与低表达EGFR的人结肠癌细胞株Lovo和SW620,经慢病毒感染上荧光素酶基因与绿色荧光蛋白基因后注射到裸鼠皮下和结肠壁,构建裸鼠结肠癌皮下和原位移植瘤模型,经裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型尾静脉注射200ug/200ul ICG-Cetuximab后,利用小动物活体成像仪进行连续动态荧光分子成像(Fluorescence Molecular Imaging,FLI),Living image软件量化分析肿瘤部位荧光信号强度。裸鼠结肠癌原位移植瘤离体标本在200ug/200ul ICG-Cetuximab溶液中室温孵育,充分浸洗,洗脱未结合的探针后进行离体FLI。随后进行肿瘤组织病理学和免疫组织化(Immunohistochemistry,IHC)检测,明确EGFR的表达情况,并与FLI结果对比。[结果]1.ICG中的琥珀酰亚胺基与西妥昔单抗的氨基共价结合成功构建了近红外荧光分子探针ICG-Cetuximab,当加入的西妥昔单抗为200ug时,利用紫外可见分光光度计检测后计算出标记上ICG的西妥昔单抗所占比率较高,为56.37±3.34%。最后实验确定1个ICG Labeling-NH2样品标记200ug蛋白。2.活体FLI显示裸鼠皮下移植瘤模型(Lovo-GFP-Luc)注射探针ICG-Cetuximab后立即在肝脏浓聚,逐渐向皮下移植瘤聚集,注射后24h在瘤体部位达浓聚高峰,平均荧光强度是注射前的2.16±0.21倍。48h探针特异性靶向效果更佳。持续成像168h仍可在瘤体部位清晰观察到荧光信号,与正常组织对比明显。未与瘤体结合的探针在注射后2天主要经肝脏代谢,经肠道逐渐排出体外。两对照组中,探针注射后立即全身分布,随即在肝脏浓聚,48h后几乎完全经肝脏代谢,经肠道排出体外。注射探针后至48h持续成像,均未在瘤体探测到特异性的荧光信号。实验组荷瘤鼠在注射探针后24h进行FLI和生物发光成像(Bioluminescence imaging,BLI),共定位结果表明探针的确是在肿瘤部位浓聚。离体裸鼠结肠癌原位移植瘤与ICG-Cetuximab溶液孵育后FLI结果显示原位结肠癌部位有较强的荧光信号,且与瘤体旁正常黏膜对比明显,孵育5min和15min后,瘤体平均荧光信号强度分别是瘤体旁正常黏膜的3.56±0.34和3.44±0.30倍。组织HE染色证实移植瘤均为结肠癌。IHC结果证实Lovo-GFP-Luc皮下和原位移植瘤均可见EGFR明显表达,SW620-GFP-Luc皮下移植瘤未见明显EGFR表达。免疫组化结果与荧光探针对EGFR的靶向性结合具有良好的一致性。[结论]利用FDA批准的近红外荧光染料ICG与Cetuximab共价结合成功构建了靶向EGFR的荧光分子探针ICG-Cetuximab,经裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型尾静脉注射ICG-Cetuximab后进行连续动态活体荧光分子成像,验证了ICG-Cetuximab对结肠癌的靶向性和荧光效率。利用探针溶液孵育裸鼠结肠癌原位移植瘤后进行离体荧光分子成像,证实了基于ICG-Cetuximab的荧光诊断成像凸显肿瘤病变、指导活检的能力。