产原果胶酶菌株的筛选、发酵条件优化及基因的克隆和表达

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原果胶酶能够催化水不溶性的原果胶,并释放水溶性果胶;在工业上,原果胶酶可以用于果胶的提取。本研究主要从以下三个方面开展:1、高产原果胶酶菌株的筛选。从果园土壤和腐烂的水果中筛选得到7株高产原果胶酶的菌株,取酶活最高(113.3U/ml)的一株进行接下来的研究。通过ITS5.8S rDNA对该菌株进行鉴定,该菌株和Aspergillus oryzae IC-A3的相似性为100%,将其命名为Aspergillus oryzae PO。2、对该菌株进行发酵条件的优化,首先通过单因素优化选择对产酶影响较显著的三个因素(温度、NaNO3和苹果渣),之后用响应面的方法对该三因素进一步优化,经优化后酶活最高达270.0U/ml,比优化前提高2.38倍。3、经测定,该原果胶酶含有聚半乳糖醛酸酶和聚阿拉伯糖苷酶活性。将聚半乳糖醛酸酶的基因克隆,并在Pichia pastoris GS115中进行表达,表达后酶活高达1674U/ml,比野生菌高558倍;表达量为0.418mg/ml;用阴离子交换柱进行一步纯化,收率和纯化倍数分别为87.14%和1.31倍,酶的比活为7519.54U/mg;对该酶的酶学性质进行研究,最适pH和温度分别为5.0和45℃,Mg2+能够促进酶活,Ca2+, Ni2+, Mn2+、Cu2+和十二烷基硫酸钠能够强烈的抑制酶的活性,吐温20、60和80对酶活基本没有影响;对聚半乳糖醛酸的Km和Vmax值分别为5.59mg/ml和1.01μmol·(min-ml)-1。
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