论文部分内容阅读
目的:应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ion ization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术研究膀胱癌患者与健康人群之间的差异血清多肽图谱,寻找潜在的膀胱癌血清多肽生物标志物,建立高敏感性和特异性的早期膀胱癌血清学诊断模型,在早期膀胱癌的诊断方面为临床提供重要的参考依据。方法:(1)收集67例膀胱癌患者、64例健康体检者及30例患有泌尿系结石伴随肉眼血尿症状患者的血清样本,将所有膀胱癌患者与健康体检者随机分成训练组(32例膀胱癌患者和31例健康体检者)及验证组1(35例膀胱癌患者和33例健康体检者),利用弱阳离子交换磁珠法(WCX-MB)富集提取血清多肽,MALDI-TOF-MS技术检测各样本血清多肽图谱,BioExplorer软件分析比较训练组中膀胱癌组与健康体检组的图谱,寻找差异多肽峰。(2)ROC曲线分析(Receiver operating characteristics curve analysis)评估各差异多肽的诊断价值,应用BioExplorer软件内部算法构建膀胱癌的血清多肽诊断模型,计算该模型对于膀胱癌各分期的灵敏度及特异性。(3)以验证组1中的35例膀胱癌患者和33例健康体检者的血清样本来验证该模型的诊断灵敏度及特异性,并以30例血尿患者的血清样本作为另一个验证组(验证组2)来验证该模型的特异性。(4)将39例早期膀胱癌患者进一步分成早期低级别膀胱癌组(20例)与早期高级别膀胱癌组(19例),分别应用于诊断模型中进行分类并与健康体检者进行比较,得到该模型对于早期不同分级膀胱癌诊断的灵敏度及特异性。(5)利用全自动化学发光免疫分析仪检测癌胚抗原(CEA)在早期膀胱癌、健康体检者及血尿患者血清中的表达水平,采用ROC曲线分析CEA在早期膀胱癌中的诊断能力。(6)应用纳米液相色谱联合电喷雾电离串联质谱(nano-LC-ESI-MS/MS)鉴定训练组中差异血清多肽序列,进一步依据序列比对蛋白数据库,鉴定各差异多肽。(7)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测诊断模型中鉴定出的蛋白分别在膀胱癌患者及健康体检者血清中的表达水平,比较分析膀胱癌组与健康体检者组是否存在差异。结果:(1)本研究通过对训练组中膀胱癌患者和健康体检者的血清多肽图谱进行比较分析,共得到50个多肽峰,其中17个有统计学差异(P<0.05),13个多肽峰强度在膀胱癌中表达上调,4个多肽峰强度在膀胱癌中表达下调。(2)进一步根据多肽峰强度的高低及其在两组之间的差异倍数大小,我们筛选出5个多肽(m/z 1954.9 Da、m/z 2081.0 Da、m/z 3938.3 Da、m/z 3946.5 Da、m/z 4268.8 Da)。与健康体检者组及血尿患者组相比较,膀胱癌组中5个多肽峰的峰强度均表达升高,在早期膀胱癌患者中也表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线结果显示各多肽峰的曲线下面积(Area under curve,AUC)值分别为0.778(95%CI:0.659-0.898,P<0.001)、0.862(95%CI:0.768-0.955,P<0.001)、0.859(95%CI:0.769-0.950,P<0.001)、0.837(95%CI:0.741-0.933,P<0.001)和0.787(95%CI:0.675-0.900,P<0.001),将5个多肽峰进行联合诊断AUC值为0.923(95%CI:0.857-0.990,P<0.001)。最终以这5个多肽构建膀胱癌诊断模型,灵敏度及特异性分别是93.75%和96.77%。该模型对早期膀胱癌(Ta stage)的灵敏度达92.31%,特异性达93.75%,侵袭性T1-T4期膀胱癌的灵敏度及特异性是85.71%与93.75%。(3)以验证组1来验证该模型,灵敏度是91.43%,特异性是90.91%,以验证组2来验证该模型,诊断特异性为73.33%。(4)五肽诊断模型对于早期低级别膀胱癌的灵敏度达90%,对早期高级别膀胱癌灵敏度达94.74%。ROC曲线分析结果显示,该模型诊断早期低级别膀胱癌的AUC值是0.944(95%CI:0.871-1.000,P<0.001),诊断早期高级别膀胱癌的AUC为0.963(95%CI:0.916-1.000,P<0.001)。(5)早期膀胱癌患者血清CEA平均浓度是2.53±1.44 ng/ml,健康体检者血清CEA平均浓度是2.21±1.50 ng/ml,血尿患者血清CEA平均浓度是2.32±0.99ng/ml。将早期膀胱癌患者CEA水平与健康体检者进行ROC曲线分析,AUC值是0.593(95%CI:0.458-0.727),P=0.174,两组结果比较无统计学差异。将早期膀胱癌患者CEA水平与血尿患者进行ROC曲线分析,AUC值是0.529(95%CI:0.391-0.666),P=0.685,两组结果比较无统计学差异。(6)模型中5个血清多肽有2个多肽经纳米液相色谱电喷雾电离串联质谱鉴定为胎球蛋白A(alpha-2-HS-glycoprotein,AHSG)和血清转铁蛋白。(7)ELISA检测所有膀胱癌患者血清中AHSG及转铁蛋白的表达水平,两种蛋白的浓度均明显高于健康体检者,结果存在统计学差异(P<0.05)。结论:(1)基于WCX-MB的MALDI-TOF-MS技术能够分析复杂的血清样本中的多肽,通过比较膀胱癌患者与健康人群的血清多肽图谱,筛选两者之间的差异多肽峰,建立了一个包含5个多肽的膀胱癌血清学诊断模型,这一模型在膀胱癌的诊断方面具有较高的灵敏度和特异性。(2)应用该模型诊断早期膀胱癌具有明显优势,灵敏度可达92.31%,即使早期低级别膀胱癌也具有较高的灵敏度,且可与健康人及有血尿症状的泌尿系结石患者进行鉴别。因此该模型可用于膀胱癌高危人群的早期筛查,尤其在早期诊断方面具有重要价值。(3)模型中2个血清多肽经质谱鉴定出分别为AHSG和转铁蛋白,均在膀胱癌患者血清中表达升高,这两个蛋白可能参与膀胱癌的增殖、侵袭与转移,为继续深入研究膀胱癌的发病机制提供了新思路。