目的:在STO小鼠成纤维细胞中稳定高效表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和小鼠白血病抑制因子(mouse leukemia inhibitory factor,m LIF),并尝试使用其作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞(m ESCs)。方法:构建带有GFP、m LIF和抗嘌呤霉素基因的慢病毒载体并测序验证,与慢病毒包装载体ps PAX2和VSV-G共转染HEK293F细胞来制备慢病毒颗粒,并用该慢病毒感染STO小鼠成纤维细胞系,利用嘌呤霉素筛选得到稳定高效表达GFP和m LIF基因的细胞系(STO-GFP-m LIF);通过Western blot、ELISA检测STO-GFP-m LIF细胞中m LIF基因的表达量;经不同质量浓度(5,10,15,20μg/ml)丝裂霉素C处理不同时间(1.5,2.5,3,3.5 h)制备饲养层,通过MTT法检测各组细胞的增殖活力;将小鼠胚胎干细胞在丝裂霉素C处理过的STO-GFP-m LIF上培养,镜下观察细胞集落生长情况。结果:荧光显微镜能检测到慢病毒感染HEK293F细胞后GFP的表达;Western blot和ELISA结果显示STO-GFP-m LIF细胞中m LIF蛋白表达水平上调(P<0.01);丝裂霉素C抑制STO-GFP-m LIF细胞增殖的最佳浓度及作用时间为10μg/ml,3 h,且小鼠胚胎干细胞可在该饲养层上能发育成典型的“鸟巢”状干细胞集落。结论:构建含有GFP-m LIF-puro基因的慢病毒载体和慢病毒包装载体制备出的慢病毒颗粒感染STO细胞后,可获得稳定高效表达绿色荧光蛋白和小鼠白血病抑制因子基因STO-GFP-m LIF细胞系,此细胞系作为饲养层可维持小鼠ES细胞未分化状态。