碎囊毛霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的提取纯化及其酶学性质研究

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微生物制麦是制麦的新技术,而启动子菌株则是微生物制麦的灵魂。前期研究已表明,碎囊毛霉M-28(Mucor petrinsularis)是一种有效的制麦启动子菌株。本文基于碎囊毛霉M-28为实验材料,以固态发酵方式,采用单因素试验方法,对其所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行提取纯化条件优化,并开展部分酶学性质研究,旨在为其应用于微生物制麦过程提供科学依据。取得主要的研究结果如下:1.确定的碎囊毛霉M-28β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳抽提条件为pH5.5的HAc-NaAc缓冲液、200r/m振荡、浸提时间30min,最终所得粗酶酶活力9.041U/ml,蛋白质含量为0.140mg/ml,酶比活力为64.583U/mg。2. β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最优纯化条件是粗酶液先经过饱和度80%的硫酸铵盐析,通过透析24h浓缩处理,再经Sephadex G-100柱凝胶过滤后,得到了电泳纯酶,酶比活力达到225.02U/mg,纯度较粗酶样提高了3.48倍。3. β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质是该酶与底物最佳反应时间为10min,不能耐受较高的温度,在40-50℃时相对稳定,最适反应温度为55℃;酶活力在pH值4.5-5.5条件下相对稳定,最适pH值为5.5;初步明确了该酶的酶活动力学特性,得到该酶米氏常数与最大反应速度分别为Km=263.16ug/mL、Vm=28.54ug/min.mL、不同浓度的Fe3+在β-1,3-1,4-葡聚糖酶反应过程中,只改变反应速度,不改变米氏常数,其抑制作用属于典型的非竞争性抑制,不同浓度的尿素在β-1,3-1,4-葡聚糖酶反应过程中,既改变反应速度,也改变米氏常数,其抑制属于典型的混合型抑制。4.探讨了不同物质对该酶热稳性的影响,以及不同金属离子、化合物对该酶酶活力的影响。所得结果为明胶、白蛋白、黄原胶对该酶有较好的保护作用,甘油、海藻糖、抗坏血酸、甘露醇和山梨酸钾对该酶不具有保护作用;根据正交试验所得该酶最佳的复配保护剂为白蛋白1.8%、明胶2%、黄原胶0.25%;Fe3+和Al3+对其有抑制作用,Fe3+的抑制作用强于Al3+,Fe2+对其有激活作用,其他金属离子对其影响不大;尿素、疏基乙醇对其有抑制作用,尿素的抑制作用明显强于疏基乙醇,SDS对该酶的影响不显著;根据底物特异性实验得到该酶属于β-糖苷键型酶。
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