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吡咯里西啶生物碱（Pyrroliaidine alkaloids,PAs）是一类常见的天然化合物,存在于3%的开花植物中,已经鉴定的PAs及其氮氧化物（PA N-oxides）约有660种,其中大多数具有肝毒性。据报道,含有PAs植物约有6000多种,主要包括菊科（Fabaceae）,豆科（Leguminosae）和紫草科（Boraginaceae）植物。野百合碱（Monocrotaline,MCT）属于吡咯里西啶生物碱,是一种不含α,β不饱和双键的11元大环二酯类化合物,主要来源于豆科猪屎豆属（Crotalaria Linn.）植物。猪屎豆属植物具有种类多、分布广等特点,家畜因误食或过量采食含有野百合碱的猪屎豆属植物而中毒的事件屡见不鲜。野百合碱主要靶器官为肝脏,长期摄入会引起动物肝损伤,甚至造成死亡。目前天然草地含野百合碱类有毒植物引起的家畜中毒,给草地畜牧业造成严重经济损失,制约了草地畜牧业的可持续发展。因此,阐明野百合碱肝损伤作用机制,揭示野百合碱致肝损伤关键调控蛋白,可为研发野百合碱解毒药物提供科学依据。大量研究报道内质网应激及其介导的自噬和凋亡在多种肝脏疾病发生发展中发挥重要作用。当内质网应激持续发生则会诱发细胞凋亡。同时,过度的内质网应激会引起自噬过度激活,引起大量细胞被降解,从而诱导细胞凋亡。因此,本试验以大鼠为研究对象,通过建立野百合碱肝损伤体内模型,检测内质网应激、自噬和凋亡相关蛋白表达变化,探究野百合碱引起肝损伤时是否存在内质网应激、自噬和凋亡的发生。同时,以大鼠原代肝细胞为细胞模型,通过体外添加野百合碱,进一步探究内质网应激、自噬和凋亡在野百合碱致肝细胞损伤中的作用关系及其关键调控蛋白,阐明内质网应激介导自噬和凋亡在野百合碱致肝脏毒性损伤的作用机制。本研究取得以下结果:1.明确野百合碱致大鼠肝损伤可诱发内质网应激、自噬和凋亡。本研究利用不同浓度野百合碱（45 mg/kg和90 mg/kg）一次性灌胃雄性SD大鼠,染毒48 h后,采集血样检测血液生化指标,如丙氨酸氨基转移酶活性（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶活性（AST）和总胆红素（T-Bil）。结果发现,与对照组相比,ALT和AST活性及T-Bil含量均升高,且具有剂量依赖效应。采集肝脏组织,进行肝脏系数计算,与对照组相比,45 mg/kg剂量组的肝脏系数无明显变化,而90 mg/kg剂量组显著升高。HE染色观察发现,野百合碱45 mg/kg组有轻度窦性出血,窦性扩张,肝细胞核固缩;野百合碱90 mg/kg组出现肝索形态紊乱,窦道扩张、出血,肝细胞凝集性坏死以及中心静脉内皮损伤。利用蛋白免疫印迹和免疫组织化学等方法,发现野百合碱能够引起内质网应激相关蛋白GRP78、p-e IF2α、ATF4、CHOP、p-IRE1、Caspase-12和ATF6表达升高。并且,野百合碱能够通过抑制PI3K/AKT/m TOR通路蛋白磷酸化表达,激活自噬相关蛋白LC3II、Becline-1和Atg5的表达,且增强p62蛋白的降解。进一步诱导caspase依赖性凋亡的发生,从而造成肝脏损伤。2.阐明内质网应激对野百合碱诱导大鼠原代肝细胞凋亡的调控作用。本研究通过改良Seglen法分离得到大鼠原代肝细胞。通过台盼蓝染色计算肝细胞活率,利用免疫荧光染色对肝细胞中CK18蛋白进行鉴定,采用PAS染色分析肝细胞纯度,证明大鼠原代肝细胞活率和纯度可供研究使用。利用不同浓度野百合碱（100、200、300和400μM）分别处理肝细胞6、12、24、36和48 h后,通过CCK-8检测细胞活力,表明300μM野百合碱处理肝细胞36 h会显著抑制细胞活力。利用流式细胞术和western blot检测发现野百合碱对肝细胞凋亡具有剂量依赖效应。通过透射电镜观察肝细胞发现,野百合碱处理后引起肝细胞内质网腔明显扩展。Western blot检测发现,内质网应激相关蛋白GRP78、p-IRE1α、ATF6、p-e IF2α、ATF4和CHOP的表达,发现均随着剂量升高而显著升高。利用内质网应激抑制剂4-PBA预处理大鼠原代肝细胞4 h,发现4-PBA可以显著抑制野百合碱引起的内质网应激,缓解肝细胞凋亡。CHOP是凋亡上游调节因子,利用si RNA沉默CHOP蛋白的表达,发现si CHOP具有抑制肝细胞凋亡的作用。结果表明,内质网应激介导野百合碱诱导大鼠原代肝细胞发生凋亡,CHOP蛋白是内质网应激调节凋亡发生的关键因子。3.揭示内质网应激介导自噬在野百合碱诱导大鼠原代肝细胞凋亡的调控作用。本研究通过透射电镜观察和蛋白免疫印迹方法,发现野百合碱处理后大鼠原代肝细胞中自噬体数量以及自噬体形成相关蛋白LC3II、Becline-1和Atg5均显著升高,且p62蛋白降解明显增加,说明野百合碱能够引发肝细胞发生完全自噬反应。为分析内质网应激对自噬的调节作用,4-PBA预处理肝细胞后发现,抑制内质网应激可增强PI3K/AKT/m TOR通路蛋白的磷酸化,从而抑制细胞自噬的发生。为进一步探究内质网应激过程中CHOP蛋白对自噬的调节作用,利用si RNA沉默CHOP基因后发现,si CHOP可以抑制LC3II、Becline-1和Atg5的表达以及p62蛋白降解,同时增强AKT和m TOR的磷酸化水平。结果表明,内质网应激能够通过CHOP蛋白抑制AKT/m TOR磷酸化,从而激活自噬;为分析内质网应激介导自噬在野百合碱致肝细胞凋亡中的作用,分别利用自噬激动剂Rapamycin和抑制剂Bafilomycin和Chloroquine预处理肝细胞,并对野百合碱引起的肝细胞凋亡情况进行检测。结果发现,Rapamycin增加肝细胞凋亡率和cleaved caspase-3的表达,而Bafilomycin和Chloroquine降低肝细胞凋亡和cleaved caspase-3的表达。结果表明,内质网应激介导自噬促进野百合碱引起的肝细胞凋亡的发生,CHOP是内质网应激调控自噬的关键蛋白。综上所述,本试验以野百合碱为研究对象,以大鼠与大鼠原代肝细胞为模型,通过野百合碱致大鼠肝损伤的体内体外试验,探究内质网应激、自噬和凋亡在野百合碱诱导肝损伤发生过程中的作用关系。体内研究证实野百合碱能够引起大鼠肝脏损伤,并导致内质网应激、自噬和凋亡的发生。体外研究揭示野百合碱诱导内质网应激引起肝细胞凋亡,并发现CHOP是野百合碱调节内质网应激诱导凋亡的关键蛋白;通过4-PBA抑制内质网应激及si RNA沉默CHOP蛋白表达,明确内质网应激促进野百合碱诱导自噬的发生,而CHOP是内质网应激介导自噬发生的关键因子;证实内质网应激介导自噬增强野百合碱诱导的肝细胞凋亡。本研究为阐明野百合碱肝毒性机制奠定分子基础,为探寻治疗野百合碱致肝损伤的药物新靶点提供理论依据,以期为野百合碱解毒药物的研发提供科学指导。