辣椒（Capsicum annuum L.）是非常重要的蔬菜作物，具有很高的营养价值和经济价值。辣椒的主要辣味成分辣椒素（Capsaicin）具有多种药理与生理学活性，其含量是辣椒品质鉴定的重要指标之一。辣椒素合成酶（Capsaicinoid Synthetase）是辣椒素合成过程中的最后一个酶，也是关键性的限速酶。本研究通过农杆菌介导的遗传转化将编码该酶的C基因（即辣椒素合成酶基因）导入甜椒和辣椒品种，通过转化植株的表型分析探讨其是否具有使甜椒合成辣椒素的功能，以期为高含量辣椒素的品种选育提供新的育种途径。通过对该基因表达的调控必将大大提高辣椒辣味程度及辣椒素含量的人为可调控性并有效改变辣椒食用品质，从而推动辣椒育种工作的发展。 本研究获得的主要成果如下： 1．以4个甜（辣）椒品种为试材，分别就无菌苗苗龄，不同辣椒基因型和外植体类型、培养基成份等对子叶离体再生的影响进行了较为系统深入的探讨，建立了辣椒子叶高效植株再生体系。 （1）芽的诱导分化：以子叶为外植体，MS为基本培养基，对辣椒不定芽的诱导分化的研究结果为：16d苗龄的中椒5号和湘椒八号的子叶外植体的再生率最高；分化培养基中添加10mg／L AgNO<,3>可有效避免外植体分化时期的褐化现象；分化培养基中生长素IAA对诱导芽分化的作用远高于NAA。筛选出子叶不定芽高效分化培养基：MB＋6-BA5.0mg／L＋IAA 1.0mg／L＋AgNO<,3> 10.0mg／L＋蔗糖20g／L＋卡拉胶8g／L，分化率达80％以上。 （2）不定芽的伸长：激素组合为6-BA2.0mg／L，IAA0.3mg／L时不定芽生长最为旺盛，可基本满足芽正常生长对激素的需求；添加GA<,3> 2.0mg／L时芽伸长效果最好；芽伸长阶段培养基硬度和三角瓶中的空气湿度等环境条件的影响也很大，卡拉胶用量为6g／L，采用塑料薄膜封口，可基本达到芽迅速伸长所需的环境条件，伸长效果明显。最终确定最佳不定芽伸长培养基为：MS＋6-BA 2.0mg／L＋-IAA 0.3mg／L＋蔗糖20g／L＋GA<,3> 2.0mg／L。 （3）生根：在辣椒芽的生根上，1／2MS培养基优于MS培养基，低浓度的IAA优于高浓度的IAA。最终确定最佳生根培养基为：1／2MS＋NAA 0.1 mg／L＋IAA0.2mg／L＋蔗糖20g／L＋卡拉胶8.0mg／L。从外植体接种到完整再生小苗获得，大约 需要50～60天。 2．以16d中椒5号和湘椒八号无菌苗子叶为外植体，在芽分化培养基上预培养2d，当农杆菌菌液的pH值为5.2，OD<,600>为0.8时，浸染子叶15min，置于添加200μM AS的共培养基中在23℃黑暗条件下共培养2d，具有较高的转化效率。选择分化培养基中添加抑菌素Ticarcillin 200mg／L，可有效的抑制共培养后农杆菌的生长并不会对外植体的再生造成太大的影响，效果优于氨苄青霉素和羧苄青霉素。菌液浸染外植体20天后调查出芽率，Kan浓度250mg／L 时中椒5号和湘椒八号子叶外植体的分化被完全抑制，作为选择压。转化芽在含相同浓度的抑菌素和卡那霉素的伸长培养基中伸长至2～3cm时，移入含Ticarcillin 150，Kan浓度175mg／L的选择生根培养基中生根，每14d继代一次。 3．以中椒5号、湘椒八号，05RW21和04QR3四个辣椒品种的子叶为受体，以C基因为目的基因，应用根癌农杆菌介导法进行了遗传转化。通过卡那霉素选择培养，C基因特异引物PCR检测和去除农杆菌污染PCR检测得到了16个阳性株，6株为中椒5号，5株湘椒八号，3株05RW21和2株04QR3。选其中4株中椒5号和3株湘椒八号进行Southern杂交检测，证实7株阳性株的C基因已经整合到辣椒基因组中。RT-PCR检测转化C基因阳性植株中2株有较高表达，一株表达较弱，4株表现为转基因沉默。 4．利用美国康乃尔大学构建的含C基因的双元表达载体pBIAT<,3>通过序列测定和比对获得C基因的编码序列。该序列包含一个1323bp完整开放阅读框，648bp的内含子和182bp的3’末端，共编码一个由441个氨基酸组成的蛋白质，其核苷酸序列与乙酰基转移酶具有87.6％的相似性。 5．以特异引物CS-F／CS-R扩增36个品种（包括甜椒自交系、辣椒、牛角形甜椒及微辣型辣椒F<,2>（辣×甜））的基因组DNA。统计扩增结果，甜椒和牛角形甜椒0537有一条约1700bp的片段，辣椒，微辣型辣椒和牛角形甜椒0538除了这条带外还有一条约1400bp的片段。将辣椒0525和牛角形甜椒0538的两个片段，甜椒052的长片段分别回收后测序，通过网上BLAST和序列比对分析了各片段的同源性。确定辣椒短片段即为C基因序列，其同源长片段为与乙酰基转移酶有关的Catf2基因，与C基因的核苷酸序列具有87.3％的相似性，氨基酸序列有88.9％的相似性，有一个670bp的内含子。引物BF6／BR8对甜椒052和辣椒0525的DNA扩增，测序并比对结果显示，甜椒C基因5’端存在689bp的缺失，可能是导致甜椒辣味的消失的原因。 6．研究了C基因5’端完整却同样不具辣味的牛角形甜椒0538，其C基因编码区第40位有一处G替代为A的单碱基突变，该变异使第14位疏水性天冬氨酸变为亲水性天冬酰胺可能造成信号肽失去功能，导致辣椒素合成酶不能正常折叠成具有功能的成熟蛋白或者不能将成熟蛋白转运到目的部位最终使辣味丧失。 7．辣椒基因组DNA中含有转化外源C基因的同源序列Catf2基因，二者编码序列的长度难以区分，因此在用RT-PCR的方法检测转基因阳性植株外源基因的表达时会存在问题。我们首先对辣椒基因组中C基因和Catf2基因的表达规律进行了分析。C基因的表达是组织特异性的且表达量随果实发育时期而变化，即C基因是在花后20天的辣椒果实胎座隔膜的表皮细胞上高表达的。通过在辣椒不同器官：根、茎、叶、花、果实、种子中分析Catf2基因的表达证明它是组成型表达的。 8．用C基因特异引物CS-F/CS-R扩增117个单株的DH群体（Yolo wonder×Perennial），将辣椒短片段插入已有的辣椒图谱，确定连锁关系，命名为标记Capsaicin。又将甜椒Yolo wonder和辣椒Perennial长片段分别克隆测序后在内含子中具有15个碱基差别处合成辣椒长片段特异扩增引物SP-L/CS-R6，命名为标记SP-L。两个标记扩增群体及定位结果完全相同，说明辣椒短片段确与辣椒的辣味连锁。原连锁图中C标记与Capsaicin有5个厘摩的遗传距离，推测C的标记方法是人为品尝或测定辣椒素含量等可能存在误差。