【摘 要】
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目的:在单细胞尺度下,探讨粪肠球菌和白色念珠菌的相互作用及其对菌株耐药性的影响。为多菌、原位菌群乃至生物膜等复杂结构的生长互作及耐药性研究构建一个普适性的研究体系。为后期个性化用药、精准用药奠定基础。方法:（1）不同浓度重水作用于粪肠球菌ATCC29212后,首先测定粪肠球菌细胞的生长变化(吸光度值OD600),同时测定粪肠球菌的代谢活性随着时间的变化（采集单细胞拉曼光谱求得C-D ratio值）
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目的:在单细胞尺度下,探讨粪肠球菌和白色念珠菌的相互作用及其对菌株耐药性的影响。为多菌、原位菌群乃至生物膜等复杂结构的生长互作及耐药性研究构建一个普适性的研究体系。为后期个性化用药、精准用药奠定基础。方法:（1）不同浓度重水作用于粪肠球菌ATCC29212后,首先测定粪肠球菌细胞的生长变化(吸光度值OD600),同时测定粪肠球菌的代谢活性随着时间的变化（采集单细胞拉曼光谱求得C-D ratio值）。通过对比基于生长和基于代谢的两种评价体系,确定了重水拉曼技术评价细菌代谢活性的灵敏性及普适性。（2）不同浓度的白色念珠菌ATCC10231作用于粪肠球菌ATCC29212后,首先测定粪肠球菌细胞的生长状态随时间的变化(吸光度值OD600),同时测定粪肠球菌的代谢活性随着时间的变化（采集单细胞拉曼光谱求得C-D ratio值）。在此基础上,探究白色念珠菌对粪肠球菌的生长及代谢活性的影响。（3）采用重水拉曼技术,以最低代谢活性抑制浓度（MIC-MA）为参考指标,探究口腔常用根管冲洗液对粪肠球菌代谢活性的影响;比较不同浓度白色念珠菌作用后根管冲洗液作用于粪肠球菌的MIC-MA,以探讨白色念珠菌对粪肠球菌的耐药性影响。（4）探究白色念珠菌对粪肠球菌的基因功能和代谢通路的影响,从单细胞层面阐述受到白色念珠菌作用后粪肠球菌基因表达功能差异以及代谢反应的变化。结果:（1）粪肠球菌的生长在30%的重水环境中没有受到抑制（p＞0.05）,而在40%的重水环境中生长受到显著抑制（p＜0.05）;粪肠球菌在生理状态下积极代谢重水,这在拉曼图谱中通过特定区域以重水峰的形式展现,重水峰面积与重水浓度呈正相关（R~2=0.96,p＜0.01）。因此,重水峰可以用来表征细胞的代谢活性。综上,本实验选择了不影响菌株生长且能产生明显重水峰的重水浓度,即30%的重水作为后续研究的默认重水浓度。（2）研究发现,双菌体系下白色念珠菌不仅会抑制粪肠球菌的生长,随着白色念珠菌浓度的升高,抑制效果越加明显（p＜0.05）;并且,白色念珠菌也会抑制粪肠球菌的代谢活性,随着浓度的升高,抑制效果越加明显（p＜0.05）。通过拉曼光谱对核酸、蛋白质及脂质等“指纹图谱”[1]的观测发现,白色念珠菌作用后,粪肠球菌生物活性明显降低;拉曼光谱结合多维统计分析,可发现实验组粪肠球菌与野生株有显著差别。（3）白色念珠菌作用后,抑制住粪肠球菌代谢活性所需的药物浓度减低,表现为根管冲洗液作用于粪肠球菌的MIC-MA减低（p＜0.05）。提示双菌体系下,粪肠球菌的耐药性降低。并且,随着白色念珠菌浓度的增加,根管冲洗液作用于粪肠球菌的MIC-MA呈现逐渐降低的趋势（p＜0.05）。（4）通过分析转录组学的研究数据发现,白色念珠菌的作用抑制了粪肠球菌精氨酸代谢、群体感应和细胞间交流,为双菌体系下粪肠球菌的生长、代谢受到抑制的情况提供了合理的解释。结论:（1）课题建立了基于重水拉曼技术评价病原菌代谢活性的普适性研究体系。（2）通过测定病原菌生长(吸光度值OD600)和代谢（C-D ratio值）的变化,证实白色念珠菌-粪肠球菌双菌体系下,粪肠球菌的生长及代谢活性都受到抑制,并且随着白色念珠菌浓度的增加,抑制程度越高。（3）研究进一步建立了基于代谢活性评价抑菌效能的双菌研究模式体系,证实白色念珠菌-粪肠球菌双菌体系下,粪肠球菌的耐药性降低。（4）最后,分析解释了双菌调控下粪肠球菌的变化,阐述了白色念珠菌对粪肠球菌的基因表达功能和代谢反应的负面影响。
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