论文部分内容阅读
研究背景和意义诺如病毒（noroviruses,NoVs）是导致各年龄段病毒性胃肠炎的主要病原体。NoVs感染造成了全球巨大的的经济损失,导致了严重的公共卫生问题。开发一种有效的NoVs疫苗或抗病毒药物对于预防和治疗NoVs性胃肠炎具有重要的意义。然而,自发现NoVs以来,由于缺乏成熟的细胞培养系统,亦无合适的小动物感染模型,导致对NoVs发病机制的研究进展缓慢。目前尚缺乏针对NoVs胃肠炎的有效疫苗及抗病毒药物。经过十余年的研究,现已确认肠道黏膜上的人类组织血型抗原（human histo-blood group antigens,HBGAs）是 NoVs 的受体。目前NoVs与HBGAs受体的结合/阻断模型已作为中和实验模型的替代广泛用于抗体的中和作用和抗病毒药物的作用评价。基于主要衣壳蛋白VP1氨基酸序列的同源性,可将NoVs分为不同的基因组,每一基因组又可分为不同的基因型,同一基因型内又分为多种基因簇和变异株。目前,NoVs至少可分为十个基因组（genogroup,GI-GX）,其中,两个主要感染人的GⅠ、GⅡ基因组分别由至少9和27个不同的基因型组成。由于NoVs遗传基因和抗原的高度多样性,为疫苗的研制策略带来了巨大的挑战。为了制定科学合理的疫苗方案,2016年,Parra等通过对毒株遗传关系和自然发展模式的深入分析,将NoVs基因型分为更大的相关簇,提出了一种新模型,称为“免疫型”。其中,GⅠ包括A-C,GⅡ包括D-L。然而,目前尚缺乏对机体感染NoVs后所产生的特异性抗体保护作用以及不同基因型间的交叉保护性研究。充分阐明NoVs不同基因型间的抗原相关性将为NoVs的免疫分型理论提供科学依据,并对No Vs的疫苗研制策略具有重大的指导意义。理论与实践证明中医药对病毒性腹泻的治疗具有广阔的应用前景和良好的研究价值。课题组前期通过对中医药抗病毒性胃肠炎有效方药的文献筛选和分析,统计出主要的核心中药50余种,以HBGAs受体为靶标开展靶向阻断NoVs与HBGAs受体结合进行中药活性成分的筛选,发现涩肠止泻类中药五倍子和石榴皮具有显著阻断流行株GⅡ.4/VA387 NoV与HBGAs受体结合的作用。然而,其是否对多种NoVs流行株均具有阻断作用,尚待进一步评价。基于此,本研究选取石榴皮及其有效成分单宁酸为研究对象探索其对多种GⅡ/GⅠ.NoVs流行株的阻断作用,为“涩肠止泻”中药用于治疗NoVs性胃肠炎进一步提供新的科学依据。研究方法1.利用分子生物学方法,构建GⅡ.NoVs基因型GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.12、GⅡ.17、GⅡ.21以及GⅠ.NoVs的常见流行株GⅠ.2、GⅠ.3和GⅠ.9 P区域的重组质粒,进而利用大肠杆菌原核系统表达上述GⅡ/GⅠ.NoVs P颗粒;将表达成功的多种NoVs P颗粒分别免疫小鼠以制备NoVs小鼠血清。2.基于体外HBGAs结合实验,将表达的多种GⅡ/GINoVs P颗粒与确定分型的HBGAs唾液表型结合,分析NoVs毒株与HBGAs受体的结合谱特征,进一步明确HBGAs在不同NoVs基因型流行中的重要作用。3.利用课题组前期收集的三起暴发GⅡ.6、GⅡ.17和GⅠ.3.NoV的急性期血清,急性期-恢复期配对血清以及免疫获得的小鼠NoVs血清,通过抗体阻断实验,探讨抗体水平在NoVs暴发中的作用以及GⅡ基因组内、GⅡ/GⅠ基因组间的抗体交叉保护作用,从而分析多种NoVs毒株的抗原相关性特征。4.利用NoVs-HBGAs体外阻断实验模型,探索石榴皮以及有效成分单宁酸对GⅡ/GⅠ.NoVs流行株的阻断作用,为“涩肠止泻”中药抗NoVs性胃肠炎进一步提供科学依据。研究结果1.成功构建了九种不同NoVs毒株的重组表达质粒并利用原核表达系统表达了九株 GⅡ/GⅠ NoVs P 颗粒（GⅡ.2、GⅡ.4/VA387、GⅡ.6、GⅡ.12、GⅡ.17、GⅡ.21、GⅠ.2、GⅠ.3和GⅠ.9）,其浓度为0.1～0.7 μg/μl,满足HBGAs受体结合/阻断作用研究需求并将表达的九株NoVs P颗粒分别免疫小鼠,成功制备了相应基因型别的NoVs小鼠血清。2.GⅡ/GⅠ.NoVs基因组与HBGAs受体存在不同的结合模式:在GⅡ.NoVs中,流行株GⅡ.6均能与所有分泌型HBGAs结合;而GⅡ.2只低水平的结合B分泌型;GⅡ.12低水平的识别分泌型,不结合非分泌型;GⅡ.21不仅识别全部的A、B、AB、O分泌型,还与非分泌型HBGAs的唾液表型具有较好的结合能力三株GⅠ.NoVs毒株均能不同程度的结合分泌型以及非分泌型HBGAs,其中与B型的结合程度较低,提示B型HBGAs的个体可能免受GⅠ.NoVs的感染。3.三起GⅡ.6、GⅡ.17和GⅠ.3 NoV暴发血清的抗体水平显示:感染者的抗体阻断滴度水平均较低,GMT±GSD分别为18±2,18±2和25±1,且GⅡ.6感染者的血清抗体滴度（18±2）显著低于非感染者（66±2）（P＜0.001）。同时,暴发血清对GⅡ/GⅠ流行株抗体水平的横向比较显示:在GⅡ.6暴发血清中,暴发株GⅡ.6的抗体阻断滴度（18±2）均显著低于异型的GⅡ.4（1681±5,P＜0.001）,GⅡ.17（59±3,P＜0.001）;在GⅡ.17暴发血清中,暴发株GⅡ.17的抗体阻断滴度（18±2）均显著低于异型的 GⅡ.4（2832±5,P＜0.001）、GⅡ.6（200±3,P＜0.001）和 GⅠ.9（54±2,P＜0.001）;在GⅠ.3暴发血清中,暴发株GⅠ.3的抗体阻断滴度（25±1）均显著低于异型的 GⅡ.4（3652±4,P＜0.001）、GⅡ.6（118±3,P＜0.001）和 GⅡ.17（122±3,P＜0.001）。另外,本研究又进一步纵向比较了三起暴发的急性期血清对暴发株GⅡ.6、GⅡ.17、GⅠ.3抗体水平的差异,结果显示:GⅡ.6暴发血清对同型GⅡ.6NoV的抗体阻断滴度水平（18±2）显著低于GⅡ.17和GⅠ.3暴发血清对GⅡ.6 NoV的抗体水平,其分别为 200±3（P＜0.001）,118±3（P＜0.001）。同样,GⅡ.17 暴发血清对同型GⅡ.17NoV的抗体水平（18±2）显著低于GⅡ.6和GⅠ.3暴发血清对GⅡ.17 NoV的抗体水平,其分别为59±3（P＜0.001）和122±3（P＜0.001）,以上结果均提示低水平的血清抗体阻断滴度与NoVs的暴发有关。4.GⅡ/GⅠ.NoVs基因型的抗原相关性特征:三起NoVs暴发的配对血清对GⅡ/GⅠNoVs P颗粒的抗体阻断结果显示:在GⅡ.6暴发血清中,11对配对血清对同型GⅡ.6 NoV存在恢复期抗体阻断滴度比急性期增加≥4倍;GⅡ.17NoV与该11对血清也全部存在4～64倍的增加;GⅡ.21 NoV恢复期抗体阻断滴度也表现出与GⅡ.17相同的增加水平;GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.12以及3种GⅠ毒株与GⅡ.6暴发血清则只存在1对4倍增加或者不存在交叉阻断反应;在GⅡ.17暴发血清中,6对血清对同型的GⅡ.17NoV存在恢复期抗体阻断滴度比急性期增加≥4倍;GⅡ.21 NoV存在5对血清的抗体滴度增加4～16倍;GⅡ.6 NoV有4对血清存在4～8倍的增加;而针对GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.12以及3种GⅠ毒株则与GⅡ.17暴发血清仅存在1对或者不存在交叉阻断作用;在GⅠ.3暴发的血清中,本实验随机选取了对同型GⅠ.3 NoV抗体阻断滴度≥4倍增加的6对配对血清,其中,GG14为GⅡ.17与GⅠ.3 NoVs共感染血清,该血清对GⅡ基因组中的GⅡ.17和GⅡ.21 NoV分别存在16倍的增加,对GⅡ.6存在4倍的增加,对于GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.12 NoV则不存在交叉阻断作用;而剩余的5对GⅠ.3暴发血清均对GⅡ基因型无任何交叉阻断作用。因此,该部分的研究表明:感染后的NoV血清对同型毒株产生最强的免疫保护,GⅡ、GⅠ基因组间不存在交叉保护作用;在GⅡ基因组内,GⅡ.2、GⅡ.4、GⅡ.12和GⅡ.6或GⅡ.17NoV间不存在交叉保护作用,其属于不同的免疫分型（分别为E型、G型、D型和H型或者J型）;GⅡ.17与GⅡ.21 NoV存在交叉保护作用,其属于同一免疫分型（J型）;而GⅡ.17与GⅡ.6NoV也存在部分交叉保护作用,但属于不同的免疫分型（J型和H型）。不同基因型别NoVs小鼠血清对GⅡ/GⅠNoVs P颗粒的抗体阻断结果显示:NoVs小鼠血清对同型NoVs毒株的阻断能力最强,抗体滴度在200～3200之间。而在GⅡ.17 NoV小鼠血清中,其对异型的GⅡ.21 NoV的抗体阻断滴度达400;在GⅡ.21 NoV小鼠血清中,其对异型的GⅡ.17 NoV的抗体阻断滴度为200,而其余NoVs小鼠血清对异型NoVs毒株的抗体交叉阻断滴度大多在12.5～50之间。因此,该部分的研究同样表明:感染后的NoVs血清对同型毒株产生最强的免疫保护,GⅡ、GⅠ基因组间不存在交叉阻断作用;在GⅡ基因组内:GⅡ.17与GⅡ.21 NoV存在交叉阻断作用,其属于同一免疫分型J,而其余基因型间几乎不存在交叉阻断作用,其也属于不同的免疫分型。另外发现小鼠血清与暴发血清对GⅡ.17和GⅡ.6 NoV结果存在部分差异,推测其可能与人群的既往感染史有关。5.石榴皮及其主要有效成分单宁酸对NoVs-HBGAs结合的阻断作用结果表明:石榴皮水提液均能显著阻断GⅡ流行株GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17以及GⅠ流行株GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.9NoV P颗粒与HBGAs受体的结合,且随着石榴皮水提液浓度的增加其阻断能力也随之增强,最低有效浓度约为62.5 μg/ml;单宁酸也同样对GⅡ/GⅠNoVs流行株具有显著阻断的作用,其达到阻断多种NoVs毒株结合所需的最低浓度约为0.1.2～0.23 μmol/ml。研究结论1.GⅡ/GⅠ.NoVs具有不同的HBGAs结合特征,在GⅡ.NoVs中非分泌型能保护机体免受大部分GⅡ.NoVs的感染。而GⅠ.NoVs感染与分泌状态无关,B型HBGAs能保护个人免受大多GⅠ.NoVs的感染。HBGAs是决定结合特异性和传播风险的重要因素。2.低水平的No Vs抗体阻断滴度是NoVs在易感人群中暴发的重要机制;感染后的NoVs血清对同型毒株产生最强的免疫保护,且GⅡ、GⅠ两大基因组间不存在交叉保护作用。在GⅡ基因组内,同一免疫分型内的基因型具有交叉保护作用,而不同免疫分型间的NoVs几乎不存在交叉保护作用,但人群的既往暴露史或感染史能够影响机体对不同NoVs基因型的免疫应答。3.石榴皮及有效成分单宁酸能够显著阻断多种GⅡ/GⅠ.NoVs流行株与HBGAs受体的结合作用,对HBGAs受体结合的广谱阻断作用可能是中药“涩肠止泻”治疗病毒性胃肠炎的主要作用机制。