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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)能够引起鸡的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease, CRD),该病分布广泛,给世界各地养鸡业带来巨大的经济损失。研究表明,MG主要通过表面的黏附蛋白pMGA (Protein Mycoplasma Gallisepticum AdheA-In)与机体的受体结合而产生致病作用。课题组前期研究发现载脂蛋白ApoA-I是pMGA1.2的相互作用蛋白。本研究主要对pMGA1.2与ApoA-I相互作用的的功能结构域进行了研究,为进一步研究pMGA1.2与ApoA-I相互作用的的功能位点奠定了基础,主要研究成果如下：1.生物信息学预测pMGA1.2共有4个功能结构域,分别位于25-77位、105-166位氨基酸之间的两个FIVAR (Uncharacterised Sugar-binding Domain)结构域；位于171-596位氨基酸之间的Myco-haema (Mycoplasma haemagglutinin Domain)结构域,位于491-595位氨基酸之间的Galactose-binding domain-like结构域。2.根据预测的功能结构域将pMGA1.2分为4段,片段1:25-77aa→73-231bp,即159bp；片段2:105-166aa→313-498bp,即186bp；片段3:171-491aa→511-1473bp,即963bp；片段4:491-595aa→1471-1785bp,即315bp。成功克隆了含有pMGA1.2功能结构域的4个片段pMGA1.2-N(N=1,2,3,4)。3.成功构建了原核表达质粒pGEX-KG-pMGAl.2-1和pGEX-KG-pMGA1.2-2。将原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG浓度1mmol/L,22℃诱导8h,获得了pMGAl.2-1和pMGAl.2-2的融合蛋白；经GST亲和层析柱纯化,获得了纯度为95%的pMGAl.2-1和pMGAl.2-2的融合蛋白。Western blot研究表明,pMGAl.2-1和pMGAl.2-2融合蛋白有明显显色带,pGEX-KG空载体对照无显色带,说明获得的pMGAl.2-1和pMGAl.2-2融合蛋白具有良好的免疫学活性。病毒铺覆蛋白印迹(VOPBA)结果显示,pMGAl.2-1和pMGAl.2-2融合蛋白有明显显色带；pGEX-KG空载体对照无显色带,说明pMGAl.2-1和pMGAl.2-2融合蛋白能与纯化的ApoA-I融合蛋白发生特异性反应,说明pMGAl.2-1和pMGAl.2-2蛋白包含与ApoA-I结合的功能结构域,与生物信息学预测的结果一致。4.成功构建了真核表达质粒PG-3(pCDNA3.1-GFP-pMGAl.2-3), PR-3(pCDNA3.1-RFP-pMGAl.2-3), PG-4(pCDNA3.1-GFP-pMGA1.2-4), PR-4(pCDNA3.1-RFP-pMGA1.2-4),分别转染Hela细胞后,均产生了相应的红／绿色荧光,PR-2、 PR-4的转染效率优于PG-3、 PG-4,因此选用PR-3、 PR-4和PG-AI (pCDN A3.1-GFP-Apo A-I)单转／共转Hela细胞,流式细胞仪检测ApoA-I、pMGAl.2-3、 pMGAl.2-4蛋白的表达量,结果表明：与单转相比,共转染组ApoA-I、pMGAl.2-3、 pMGAl.2-4的表达量均极显著下调(P<0.01),说明在细胞内1MGA1.2-3、pMGAl.2-4与ApoA-I蛋白之间存在相互作用,pMGAl.2-3. pMGAl.2-4蛋白包含与ApoA-I结合的功能结构域,与生物信息学预测的结果一致。