酯类水解酶包括脂肪酶和酯酶，广泛存在于自然环境中。微生物来源的酯类水解酶具有便于工业生产、易纯化等优点，使其被广泛应用到工业、食品及医药行业等多个领域。随着生物信息学和分子生物学的发展，越来越多的新型酯类水解酶得到发现和研究，为实现其工业应用奠定了基础。海洋环境中物理、化学因素的特殊性和复杂性，造就了海洋微生物在物种资源、基因功能和生态功能上的多样性，从而有利于获取新颖的、性质独特的酯类水解酶。本文中，我们通过对大西洋深海沉积物进行功能宏基因组筛选，获得了一个类似于HTA的新型酯酶基因E22。通过生化、结构和突变分析，我们阐明了酯酶E22的生化性质、底物识别与催化的分子机制，酯酶E22及其同源序列构成HTA家族中新的亚家族的结构基础。此外，通过对两株海洋细菌的基因组进行序列筛选再结合功能筛选，我们还获得了两个新型酯酶基因EstD和EstH。　　一、新型海洋酯酶基因的功能筛选　　本文构建了大西洋深海沉积物的宏基因组文库，该文库含有17，000个fosmid克隆。通过对该文库进行功能筛选，获得了一个新的酯类水解酶基因E22。序列分析显示，E22与已报道的酯类水解酶没有结构相似性，但与多个细菌来源的HTA具有很高的序列相似性。同时，我们还对两株海洋细菌的基因组进行了序列筛选和功能筛选，获得了两个序列新颖的酯类水解酶基因EstD和EstH。对E22、EstD和EstH进行异源表达和活性分析表明，E22、EstD和EstH均为酯酶。因此，我们从海洋沉积物和细菌基因组中获得了三个新的酯酶基因。　　二、酯酶E22的酶学性质　　在Escherichia Coli BL21(DE3)中对E22进行了表达和分离纯化，并对重组酯酶E22进行了生化性质分析。酯酶E22对碳链长度在2～6个碳原子的短链酯类底物表现出较强的降解活性，最适底物为pNPC4。以pNPC4为底物时，纯化的E22的比活力为1720 U/mg，Km值为57.12μM，kcat/Km值为3.8×104 s-1 mM-1。最适反应温度是60℃，最适pH为9.0，E22对NaCl的耐受性较弱。金属离子和EDTA对E22的酶活影响很小，表明E22在催化过程中可能不需要金属离子的参与。与其他酯酶一样，E22的酶活性受Phenylmethylsμlfonyl fluoride(PMSF)抑制。　　三、酯酶E22的催化机制分析　　为了研究酯酶E22的底物识别与催化机制，我们解析了E22及其突变体L374D的晶体结构，分辨率分别为2.3(A)和1.5(A)，并将分子pNPC4对接到L374D结构中。 E22在溶液中和晶体中均形成二聚体。E22单体蛋白含有两个结构域，一个Lid结构域和一个α/β水解酶结构域。E22的催化三联体由Ser175、Asp340和His373构成，这三个催化残基均位于α/β水解酶结构域。通过分析突变体L374D与pNPC4底物复合物的结构并结合突变和生化分析，我们揭示出E22的催化机制。底物的降解分两步进行。在第一步反应中，底物进入E22的底物结合腔后其苯环上的硝基即被Arg294和Ser72固定。同时，一个电子经His373从Asp340传递给Ser175并将其激活，Ser175对底物上的羧基碳发起亲核攻击。形成一个酰基-酶(acyl-enzyme)中间产物的四面体，该四面体通过与氧离子洞残基Phe71和Met176上的主链N原子发生相互作用而得到稳定。随后His373贡献一个质子给中间产物，形成对硝基苯酚并被释放到溶液中。伴随着“丁酰化的Ser175”形成，第一步反应结束。在第二步反应中，四面体构型依然由“氧离子洞”稳定。此时，His373从周围的水分子中夺取一个质子，经活化产生的OH-对四面体中间产物上的羧基氧发起亲核攻击，从而释放丁酸，E22又回到活性状态。　　四、酯酶E22在底物识别方面区别于其它两个HTA亚家族的结构基础　　底物特异性分析表明，虽然酯酶E22在序列和结构上均与HTA家族蛋白很相似，但E22可以催化长达六个碳原子的酯酰链水解，并且不具有酰基转移酶活性。为了研究酯酶E22与其它两个HTA亚家族的不同，我们对三者的结构进行了比较分析。结果表明这三类酶具有相同的催化三联体，但是底物结合腔存在明显的差异。酯酶E22的底物结合腔表面含有更多的正电荷，这不利于乙酰-CoA疏水部分的结合。并且，E22缺少了转移酶中稳定乙酰-CoA的4个保守残基。酰基转移酶中结合Homoserine的关键带电荷氨基酸残基在E22中被替换成了疏水残基。E22的催化腔的疏水部分更深一些，使E22可以容纳长至六个碳原子的酯酰链，这些结构上的不同，使E22异于其它两个HTA亚家族类群。系统发育分析表明，E22及其同源序列聚集成独立的类群，并且该新类群与乙酰基转移酶的亲缘关系更近，表明这些酶蛋白可能是从乙酰基转移酶进化而来。对3个E22同源蛋白进行底物特异性分析表明，这些蛋白表现出与E22相似的酯酶活性，并不具备转移酶活性。这些结果表明，由E22及其同源序列构成的新类群不同于有活性的乙酰基转移酶亚家族及乙酰酯酶亚家族，是HTA家族蛋白的一个新的亚家族，我们将其命名为E22亚家族。