论文部分内容阅读
目的探讨E3泛素化连接酶CHIP在胃癌发生发展中的作用及对NF-κB信号通路的影响和潜在机制。方法构建低表达CHIP的胃癌AGS细胞株(AGS-si CHIP),采用x CELLigence系统和克隆形成实验检测细胞的生长情况。采用Ki-67和cell viability实验检测低表达CHIP对胃癌AGS细胞增殖的影响。TUNEL法检测低表达CHIP对胃癌AGS细胞凋亡的影响。采用流式细胞术分析CHIP对AGS细胞周期的影响。采用Western blot法检测两组细胞中细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路相关蛋白的表达,探讨CHIP低表达促进AGS细胞生长的机制。用x CELLigence系统和Transwell和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力。采用Western blot法检测迁移侵袭相关基因的变化。用q RT-PCR法和Western blot法检测高表达CHIP的AGS细胞和对照组细胞中TRAF2 m RNA和蛋白的表达量。构建低表达TRAF2的胃癌AGS细胞株(AGS-si TRAF2),用x CELLigence系统、CCK-8、cell viability和CFSE实验检测细胞的生长和增殖情况。采用流式细胞术检测低表达TRAF2对胃癌AGS细胞凋亡和细胞周期的影响。用x CELLigence系统和Transwell和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力。用Western blot法和Trans AM法检测低表达TRAF2对于NF-κB信号通路的影响。与免疫组化法检测胃癌组织中CHIP和TRAF2的表达量,分析两者的表达量与胃癌临床病理指标的关系、两者表达量的相关性和对生存期的影响。结果采用x CELLigence系统动态观察细胞生长,AGS-si CHIP细胞生长明显快于AGS-sictrl细胞。克隆形成实验中,AGS-si CHIP细胞形成的克隆数明显多于对照组。AGS-si CHIP组细胞培养24、48、72 h后Ki-67阳性细胞的百分率都高于对照组细胞。细胞活力实验中,在72 h AGS-si CHIP细胞的活力显著高于AGS-sictrl,且有统计学意义。AGS-si CHIP细胞中凋亡细胞显著低于对照组。AGS-si CHIP细胞在G0-G1期明显比对照组细胞缩短。Western blot法显示AGS-si CHIP细胞中p53下调,细胞周期相关蛋白CCND1、CCND3和CDK6上调。两组细胞中ERK1/2的蛋白表达没有显著差异,AGS-si CHIP细胞中ERK1/2磷酸化的p-ERK1/2蛋白表达水平显著高于对照组细胞。AGS-si CHIP细胞中Bcl-2 m RNA还是蛋白的表达量高于AGS-sictrl细胞。迁移实验中,划痕实验表明在24 h和48 h,AGS-si CHIP细胞的迁移能力明显快于AGS-sictrl细胞;Transwell实验在培养24 h后,AGS-si CHIP细胞迁移过去的细胞数明显多于AGS-sictrl细胞,且有统计学意义;用x CELLigence系统动态观察细胞迁移24 h,AGS-si CHIP细胞明显快于AGS-sictrl细胞。侵袭实验中,Transwell实验结果显示在培养24 h,AGS-si CHIP细胞穿过基质胶的细胞数目明显多于AGS-sictrl细胞,且有统计学意义(P<0.01);x CELLigence系统动态观察24 h,AGS-si CHIP细胞的侵袭能力高于AGS-sictrl细胞。Western blot法显示,AGS-si CHIP细胞中Integrinβ1的蛋白表达水平显著高于对照细胞,u PA表达水平无明显差异。Western blot法显示在AGS-h CHIP细胞中TRAF2蛋白的表达量明显低于AGS-sictrl细胞,在AGS-si CHIP细胞和AGS-sictrl细胞中没有明显变化。q PCR法检测结果显示TRAF2m RNA水平在AGS-h CHIP和AGS-ctrl细胞中的表达无差异。CCK-8实验检测细胞生长,AGS-si TRAF2细胞的荧光OD450的数值都低于AGS-sictrl细胞。用x CELLigence系统动态观察细胞生长,AGS-si TRAF2细胞生长速度明显低于AGS-sictrl细胞。在细胞生长72 h,AGS-si TRAF2细胞CFSE染料荧光强度比AGS-sicrtl细胞高。细胞活力实验中,AGS-si TRAF2细胞的活力显著低于AGS-sictrl细胞。AGS-si TRAF2细胞凋亡的百分比明显高于对照组。划痕实验结果表明在24和48 h,AGS-si TRAF2细胞的迁移能力明显慢于AGS-sictrl细胞;Transwell实验中AGS-si TRAF2细胞迁移过小室底膜的细胞数明显少于AGS-sictrl细胞;用x CELLigence系统动态观察细胞迁移,AGS-si TRAF2细胞迁移的细胞数明显少于AGS-sictrl细胞。侵袭实验中,Transwell实验结果显示,AGS-si TRAF2细胞穿过基质胶的细胞数目明显多于AGS-sictrl细胞,x CELLigence系统动态观察细胞侵袭,AGS-si CHIP细胞的侵袭能力高于AGS-sictrl细胞。Western blot法显示AGS-si TRAF2细胞中NF-κB信号通路家族成员的表达水平都低于对照组。Trans AM检测显示AGS-si TRAF2细胞中NF-κB信号通路家族成员的活性都低于对照组。胃癌组织中CHIP的表达低于癌旁组织;胃癌组织中TRAF2的表达高于癌旁组织。胃癌中CHIP和TRAF2的表达呈负相关。CHIP低表达和TRAF2高表达都会缩短胃癌的OS。TRAF2表达和肿瘤直径是影响胃癌患者OS的独立预后因素。结论1.低表达CHIP基因能显著促进AGS细胞的生长,迁移和侵袭能力,可能与ERK信号通路激活、Integrinβ1的表达上调有关。2.高表达CHIP的AGS细胞中TRAF2在蛋白水平表达下调,低表达TRAF2显著抑制胃癌AGS细胞生长迁移和侵袭能力。3.胃癌组织中CHIP的表达降低,TRAF2的表达增高。4.TRAF2的表达是影响胃癌预后的独立因素。第一部分CHIP在胃癌细胞生物学行为的影响目的探讨E3泛素化连接酶CHIP在胃癌细胞生物学行为的影响方法构建低表达CHIP的胃癌AGS细胞株(AGS-si CHIP),采用x CELLigence系统和克隆形成实验检测细胞的生长情况。采用Ki-67和cell viability实验检测低表达CHIP对胃癌AGS细胞增殖的影响。TUNEL法检测低表达CHIP对胃癌AGS细胞凋亡的影响。采用流式细胞术分析CHIP对AGS细胞周期的影响。采用Western blot法检测两组细胞中细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路相关蛋白的表达,探讨CHIP低表达促进AGS细胞生长的机制。用x CELLigence系统和Transwell和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力。采用Western blot法检测迁移侵袭相关基因的变化。用q RT-PCR法和Western blot法检测高表达CHIP的AGS细胞和对照组细胞中TRAF2 m RNA和蛋白的表达量。结果采用x CELLigence系统动态观察细胞生长,AGS-si CHIP细胞生长明显快于AGS-sictrl细胞。克隆形成实验中,AGS-si CHIP细胞形成的克隆数明显多于对照组。AGS-si CHIP组细胞培养24、48、72 h后Ki-67阳性细胞的百分率都高于对照组细胞。细胞活力实验中,在72 h AGS-si CHIP细胞的活力显著高于AGS-sictrl,且有统计学意义。AGS-si CHIP细胞中凋亡细胞显著低于对照组。AGS-si CHIP细胞在G0-G1期明显比对照组细胞缩短。Western blot法显示AGS-si CHIP细胞中p53下调,细胞周期相关蛋白CCND1、CCND3和CDK6上调。两组细胞中ERK1/2的蛋白表达没有显著差异,AGS-si CHIP细胞中ERK1/2磷酸化的p-ERK1/2蛋白表达水平显著高于对照组细胞。AGS-si CHIP细胞中Bcl-2 m RNA还是蛋白的表达量高于AGS-sictrl细胞。迁移实验中,划痕实验表明在24 h和48 h,AGS-si CHIP细胞的迁移能力明显快于AGS-sictrl细胞;Transwell实验在培养24 h后,AGS-si CHIP细胞迁移过去的细胞数明显多于AGS-sictrl细胞,且有统计学意义;用x CELLigence系统动态观察细胞迁移24 h,AGS-si CHIP细胞明显快于AGS-sictrl细胞。侵袭实验中,Transwell实验结果显示在培养24 h,AGS-si CHIP细胞穿过基质胶的细胞数目明显多于AGS-sictrl细胞,且有统计学意义(P<0.01);x CELLigence系统动态观察24 h,AGS-si CHIP细胞的侵袭能力高于AGS-sictrl细胞。Western blot法显示,AGS-si CHIP细胞中Integrinβ1的蛋白表达水平显著高于对照细胞,u PA表达水平无明显差异。Western blot法显示在AGS-h CHIP细胞中TRAF2蛋白的表达量明显低于AGS-sictrl细胞,在AGS-si CHIP细胞和AGS-sictrl细胞中没有明显变化。q PCR法检测结果显示TRAF2m RNA水平在AGS-h CHIP和AGS-ctrl细胞中的表达无差异。结论1.低表达CHIP基因能显著促进AGS细胞的生长,迁移和侵袭能力,可能与ERK信号通路激活、Integrinβ1的表达上调有关。2.高表达CHIP的AGS细胞中TRAF2在蛋白水平表达下调。第二部分CHIP靶向调控TRAF2的机制探讨目的探讨E3泛素化连接酶CHIP对NF-κB信号通路的影响和潜在机制。方法构建低表达TRAF2的胃癌AGS细胞株(AGS-si TRAF2),用x CELLigence系统、CCK-8、cell viability和CFSE实验检测细胞的生长和增殖情况。采用流式细胞术检测低表达TRAF2对胃癌AGS细胞凋亡和细胞周期的影响。用x CELLigence系统和Transwell和划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力。用Western blot法和Trans AM法检测低表达TRAF2对于NF-κB信号通路的影响。与免疫组化法检测胃癌组织中CHIP和TRAF2的表达量,分析两者的表达量与胃癌临床病理指标的关系、两者表达量的相关性和对生存期的影响。结果CCK-8实验检测细胞生长,AGS-si TRAF2细胞的荧光OD450的数值都低于AGS-sictrl细胞。用x CELLigence系统动态观察细胞生长,AGS-si TRAF2细胞生长速度明显低于AGS-sictrl细胞。在细胞生长72 h,AGS-si TRAF2细胞CFSE染料荧光强度比AGS-sicrtl细胞高。细胞活力实验中,AGS-si TRAF2细胞的活力显著低于AGS-sictrl细胞。AGS-si TRAF2细胞凋亡的百分比明显高于对照组。划痕实验结果表明在24和48 h,AGS-si TRAF2细胞的迁移能力明显慢于AGS-sictrl细胞;Transwell实验中AGS-si TRAF2细胞迁移过小室底膜的细胞数明显少于AGS-sictrl细胞;用x CELLigence系统动态观察细胞迁移,AGS-si TRAF2细胞迁移的细胞数明显少于AGS-sictrl细胞。侵袭实验中,Transwell实验结果显示,AGS-si TRAF2细胞穿过基质胶的细胞数目明显多于AGS-sictrl细胞,x CELLigence系统动态观察细胞侵袭,AGS-si CHIP细胞的侵袭能力高于AGS-sictrl细胞。Western blot法显示AGS-si TRAF2细胞中NF-κB信号通路家族成员的表达水平都低于对照组。Trans AM检测显示AGS-si TRAF2细胞中NF-κB信号通路家族成员的活性都低于对照组。胃癌组织中CHIP的表达低于癌旁组织;胃癌组织中TRAF2的表达高于癌旁组织。胃癌中CHIP和TRAF2的表达呈负相关。CHIP低表达和TRAF2高表达都会缩短胃癌的OS。TRAF2表达和肿瘤直径是影响胃癌患者OS的独立预后因素。结论1.AGS中低表达TRAF2显著抑制胃癌AGS细胞生长迁移和侵袭能力。2.胃癌组织中CHIP的表达降低,TRAF2的表达增高。3.TRAF2的表达是影响胃癌预后的独立因素。