猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease,PCVAD）。PCV2导致猪免疫抑制,从而使猪群更容易受到其它病原感染,给养猪业造成巨大损失。淋巴细胞减少症（Lymphocytopenia）是PCVAD的特征症状,但一直以来,PCV2感染导致仔猪淋巴细胞减少症的机制并不明确。作为淋巴细胞减少症中具有代表性的CD4⁺T细胞,是机体免疫系统中一类重要的免疫细胞,能介导机体抵抗病原微生物感染。自然杀伤（natural killer,NK）细胞具有淋巴细胞杀伤活性,在体内淋巴细胞数量调节过程中发挥了重要作用。NK细胞通过表面的自然细胞毒性受体（Natural Cytotoxicity Receptors,NCRs）与靶细胞表面表达的相应配体（NCR Ligands,NCRLs）结合后识别并杀伤靶细胞。研究表明,PCV2感染能显著降低仔猪体内CD4⁺T细胞的数量,同时NK细胞的数量增加。但是,在PCV2感染猪体内NK细胞数量的增加是否与CD4⁺T细胞数量减少相关,且NCRs与NCRLs的结合是否介导了这一过程,迄今尚无报道。本研究首先构建3种猪NCRs（porcine NCRs,p NCRs）胞外域与人Ig G Fc融合蛋白真核表达载体,转染SP2/0细胞获得用于流式细胞术检测细胞表面p NCRLs表达水平的p NCRs-h Fc融合蛋白。然后,通过定量PCR检测PCV2感染后不同时间猪外周血PCV2拷贝数,流式细胞术检测PCV2感染后不同时间猪外周血CD4⁺T细胞的数量和凋亡率、NK细胞的数量以及CD4⁺T细胞表面p NCRs配体表达水平。最后,分析猪外周血PCV2拷贝数、CD4⁺T细胞的数量和凋亡率、NK细胞的数量、CD4⁺T细胞表面pNCRs配体表达水平之间的相关性。研究取得以下结果。1.通过TMHMM Server v.2.0预测并结合已知的人NCRs胞外域,确定了编码p NCR1（NM₀01123143.1）、p NCR2（XM₀21098670.1）和p NCR3（EU282355.1）的胞外域的氨基酸序列分别为:1 aa²55 aa、1 aa¹92 aa和1 aa⁹5 aa,基因序列分别为:1 bp⁷65 bp、1 bp⁵76 bp和1 bp²85 bp。根据预测结果分别合成p NCR1、p NCR2和p NCR3胞外域编码基因,同时合成人Ig G Fc（MS820429）编码基因。将人Ig G Fc基因克隆入真核表达载体pc DNA3.1成功构建pc DNA3.1-h Fc,然后分别将合成的3种p NCRs胞外域编码基因克隆入真核表达载体pc DNA3.1-h Fc,成功构建pc DNA3.1-p NCR1-h Fc、pc DNA3.1-p NCR2-h Fc、pc DNA3.1-p NCR3-h Fc真核表达载体。2.分别将构建好的真核表达载体转染SP2/0细胞,收取上清并纯化后进行浓度和纯度以及SDS PAGE和western blotting检测,结果显示,3种融合蛋白p NCR1-h Fc、p NCR2-h Fc和p NCR3-h Fc均成功表达,含量分别为1.6103μg/μL、1.9697μg/μL和2.3540μg/μL,纯度分别为94%、93%和91%。流式细胞术检测结果显示,表达的3种融合蛋白均可用于流式细胞术检测细胞表面p NCRs配体。3.将扩增的PCV2以4×105TCID50滴鼻感染5周龄断奶仔猪,在感染后第0 d、7 d、14 d和28 d分别于前腔静脉采血并分离淋巴细胞。外周血中PCV2拷贝数定量PCR检测结果显示,PCV2感染7 d、14 d和28 d,外周血PCV2拷贝数分别为3.15×105、3.76×105和4.65×105。流式细胞术检测PCV2感染仔猪外周血CD4⁺T细胞的数量结果显示,与对照组比较,在感染14 d和28 d后CD4⁺T细胞数量显著减少（p<0.05,p<0.01）,且呈时间依赖性。流式细胞术检测PCV2感染仔猪血液中CD4⁺T细胞凋亡率结果显示,与对照组比较,在感染14 d和28 d后CD4⁺T细胞凋亡率显著升高（p<0.05,p<0.01）,且呈时间依赖性。流式细胞术检测猪外周血中NK细胞数量结果显示,在感染14 d和28 d后,与对照组比较,NK细胞显著增多（p<0.05,p<0.05）。流式细胞术检测CD4⁺T细胞表面p NCRLs表达水平结果显示,与对照组比较,PCV2感染仔猪CD4⁺T细胞表面p NCR1L和p NCR3L的表达水平无显著变化（p>0.05）,而p NCR2L表达水平在感染后7 d、14 d和28 d均显著高于对照组（p<0.01）。本研究获得了3种可用于流式细胞术检测细胞表面p NCR1L、p NCR2L和p NCR3L的融合蛋白p NCR1-h Fc、p NCR2-h Fc和p NCR3-h Fc。分析猪外周血中PCV2拷贝数与CD4⁺T细胞数量和凋亡率、NK细胞数量的相关性结果显示,PCV2拷贝数与CD4⁺T细胞的数量呈负相关,与CD4⁺T细胞的凋亡率呈正相关,与NK细胞的数量呈正相关。分析猪外周血CD4⁺T细胞表面p NCR2L表达水平与PCV2拷贝数、CD4⁺T细胞数量和凋亡率的相关性结果表明,p NCR2L表达水平与PCV2拷贝数呈正相关,与CD4⁺T细胞数量呈负相关,与CD4⁺T细胞凋亡率呈正相关。研究结果为进一步探讨PCV2感染导致仔猪淋巴细胞减少症机制提供了依据。