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阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是目前发病率最高的神经退行性疾病之一,迄今临床上尚无理想治疗措施,已进入临床阶段试验的抗AD药物也多以失败告终。其可能原因在于:（1）AD早期诊断困难,干预时机过晚;（2）常用AD细胞或动物模型难以反映人类疾病特点。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是由体细胞经过重编程而得到的多能干细胞。患者来源的iPSCs携带有疾病相关的遗传及表观遗传信息,其分化过程可一定程度反映疾病的发生发展过程,被认为是构建包含AD在内的多种疾病模型的较理想工具。AD分为家族型 AD 和散发型 AD（sporadic Alzheimer’s disease,sAD）。家族型 AD 病因单一,得到的iPSCs疾病表型一致性较高,但难以反映sAD的特点;sAD由于病因复杂,得到的iPSCs疾病表型也存在较大异质性。因此,开展sAD患者来源iPSCs向神经干细胞及神经元诱导分化的研究,对于我们认识AD的发生发展以及有针对性开展药物筛选都具有重要的意义。基于此,本课题选取sAD患者为研究对象,将其外周血单个核细胞重编程为iPSCs,观察iPSCs在向神经干细胞及神经元分化过程中细胞表型和功能的变化,以期为建立可能反映AD早期阶段病理或病理生理特点的细胞模型提供实验依据,为研究AD的发生和发展提供良好的工具;在此基础上,依据AD发病早期即出现能量代谢异常的现象,开展iPSCs在分化过程中能量代谢的变化及调控机制研究,以期为AD早期诊断和干预提供实验依据。第一部分 AD患者源iPSCs向神经干细胞和神经元诱导分化过程中表型和功能的研究将年轻人（YC）、认知正常老年人（CNC）和sAD患者来源外周血单个核细胞,重编程为iPSCs,观察iPSCs向神经元分化过程中细胞表型及功能的差异,以及采用与AD发生密切相关的外源性刺激因素（H2O2和皮质醇）处理后,对细胞表型与功能变化的影响。主要结果如下:1.iPSCs表型研究sAD来源iPSCs的多能性标记物表达、EdU阳性细胞比例和拟胚体分化与YC和CNC均无显著差异,提示sAD来源iPSCs增殖能力和多向分化潜能均与YC和CNC无明显差异。2.iPSCs源神经干细胞表型研究sAD iPSCs源神经干细胞EdU阳性细胞比例低于YC和CNC;神经干细胞传代过程中,部分sAD iPSCs源神经千细胞中SlOOb阳性细胞比例显著升高,部分sAD iPSCs源神经干细胞中DCX阳性细胞比例显著升高,提示sAD iPSCs源神经千细胞表现出明显的异质性,其干性难以维持,易向胶质细胞或神经元分化。H202和皮质醇对各组神经干细胞细胞活力均无显著影响,提示sAD源神经干细胞与YC和CNC源的一样,均对过氧化及应激激素等外源性刺激不敏感。3.iPSCs源神经元表型与功能研究神经元分化过程中,sAD来源DCX阳性细胞比例、神经突长度和神经突分支节点数量均显著高于YC和CNC;sADiPSCs源神经元K+电流、Na+电流值、诱发动作电位的数量以及最大峰值均显著高于YC和CNC,提示神经元定向分化时,sADiPSCs源神经干细胞分化速度更快,电生理活性更强,具有加速成熟的表现。H202和高浓度皮质醇可显著降低sAD iPSCs源神经元活力、神经突长度以及神经突分支节点数量,而对YC和CNC源神经元无明显影响,提示sADiPSCs源神经元可能对过氧化及应激激素等外源性刺激更加敏感,更容易受到外界因素影响。第二部分能量代谢在iPSCs向神经干细胞及神经元分化中的作用研究第一部分结果显示,相较于YC和CNC,sADiPSCs源神经干细胞的干性较难维持,神经元分化速度较快,加速成熟。这与文献报道的AD早期神经发生增加,过度消耗神经干细胞池的病理表型相一致。同时,现有研究发现,AD早期常有大脑葡萄糖代谢异常的表现,而能量代谢在干细胞干性维持及分化中发挥着重要作用。因此,本部分研究首先观察iPSCs在分化过程中能量代谢表型的变化,从能量代谢角度解释sAD iPSCs源神经干细胞神经元过早分化的可能原因;随后通过调控能量代谢,观察其对sADiPSCs源神经细胞表型和功能的影响,以期为AD早期诊断和干预提供实验依据。主要结果如下:1.iPSCs向神经干细胞及神经元分化过程中能量代谢观察在iPSCs-神经干细胞-神经元这三阶段细胞中,sAD iPSCs源神经干细胞阶段细胞外酸化速率和氧消耗速率显著低于YC和CNC,而各组在iPSCs和神经元阶段无显著差异,提示sADiPSCs源神经干细胞能量代谢水平显著下降。sAD iPSCs源神经干细胞憐酸丙糖异构酶（Triose-phosphateisomerase,TPI）表达和活性以及己糖激酶（hexokinase,HK）活性均显著低于YC和CNC;Pearson相关性分析显示,TPI的表达以及HK和TPI的活性与iPSCs源神经干细胞能量代谢水平呈正相关。结果提示,sAD iPSCs源神经干细胞能量代谢下降可能与参与能量代谢相关酶的表达及活性降低有关。2.调控能量代谢对AD患者iPSCs源神经干细胞增殖及分化的影响己糖激酶抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖可显著抑制各组iPSCs源神经干细胞活力及细胞增长,増加DCX和ASCL1基因表达,增加各组DCX阳性细胞比例,减少Nestin阳性细胞比例;葡萄糖代谢中间产物果糖-6-磷酸对各组iPSCs源神经干细胞活力、增长、DCX阳性细胞和Nestin阳性细胞比例均无显著影响,但可显著减少sADDCX基因表达;PPARp/S激动剂F3SM可增加各组iPSCs源神经干细胞细胞外酸化速率,促进各组iPSCs源神经干细胞活力及增长,减少sADDCX阳性细胞比例。以上结果提示,sADiPSCs源神经干细胞向神经元分化过快可能与其能量代谢水平下降有关,而促进能量代谢可在一定程度上抑制sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快。综上所述,本研究主要得到以下结论:（1）sADiPSCs源神经干细胞传代过程中增殖能力明显下降,其干性维持具有明显异质性,且其向神经元分化速度更快,可能反映了AD早期神经发生过度增加的表型;sADiPSCs源神经元对外源性刺激因素更为敏感,可能反映了AD神经元更容易受损。提示sAD患者源的iPSCs及基于此的神经千细胞及神经元分化可能是模拟AD发生发展过程,尤其是早期过程的良好模型,值得进一步研究。（2）sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快可能与能量代谢水平下降有关,提示神经干细胞能量代谢水平变化可作为AD早期诊断的重要依据;促进能量代谢可一定程度上抑制sAD iPSCs源神经干细胞向神经元分化过快,提示调控能量代谢可作为AD早期的干预手段。