Wolbachia是普遍存在于节肢动物和丝状线虫体内的胞内共生菌,它通过雌性卵的细胞质传递给子代。目前已有研究表明,在全球范围内约有70%的昆虫种类受到Wolbachia的感染。Wolbachia主要位于节肢动物的生殖组织中,它能诱导宿主生殖方式发生多种改变,比如精卵细胞质不亲和(CI)、雌性化、孤雌生殖和杀雄等,其中CI是Wolbachia引起的最普遍的一种表型,即感染Wolbachia的雄性宿主与未感染或感染不同品系Wolbachia的雌性宿主交配后,胚胎孵化率很低甚至全部死亡。细胞学研究发现,在CI胚胎中,雄性原核发育滞后,与雌性原核发育不同步,最终导致胚胎死亡。由于Wolbachia分布广泛,且对宿主的生殖方式产生多种影响,因此它已成为最有潜力的媒介昆虫和农业害虫生物防治的工具。Wolbachia的研究,尤其是CI机制的研究以及Wolbachia对媒介昆虫宿主影响的研究已经成为国内外学者研究的热点之一。关于CI的分子机制,虽然已经有了部分的研究报道,但其确切的机制还未知。我们研究组从Wolbachia感染对果蝇精子育性的角度来研究CI的分子机制。本研究组前期以Wolbachia感染和未感染的果蝇三龄幼虫精巢为研究对象,采用microarray技术得到感染和未感染Wolbachia果蝇精子发生早期差异表达至少1.5倍的基因296个。本研究首先从这些差异表达的基因中挑选了7个差异倍数较大、且可能与生殖相关的基因(CG8627-RA、CG9081-RA、CG5320-RC、CG12052-RP、 CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA),通过定量RT-PCR (qRT-PCR)技术对其进行了体内验证,发现CG8627-RA、CG9081-RA和CG5320-RC的表达由于Wolbachia感染发生了上调,而CG12052-RP、CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA等基因的表达由于Wolbachia感染发生了下调,这与microarray的结果一致。其中CG8627-RA和CG12052-RP在Wolbachia感染和未感染的果蝇精巢中的表达水平具极显著差异(P<0.01)；而CG9081-RA、CG17934-RA和CG17268-RA的表达具显著差异(P<0.05)；另外两个基因CG5320-RC和CG7929-RA差异不显著(P>0.05)。由于在：nicroarray分析和qRT-PCR实验中,CG3767（JHI-26)基因在Wolbachia感染的精巢中都显示上调表达,且上调的倍数很高。该基因编码的保幼激素诱导蛋白26最近又被鉴定为黑腹果蝇的一个精子蛋白,而CG17934-RA (Mst84Db)在雄性生殖系中特异表达,且与精子的移动有关,因此,本研究对这两个基因进一步做了原位杂交实验,结果显示JHI-26和Mst84Db在Wolbachia感染和未感染的果蝇三龄幼虫精巢中都普遍表达,但是JHI-26在感染Wolbachia的精巢中的表达量比未感染的高,而Mst84Db的表达情况却相反,即在感染Wolbachia的精巢中的杂交信号比未感染的要弱。这正表明这两个基因确实是在果蝇幼虫精巢中表达,且Wolbachia感染导致JHI-26在果蝇早期精巢中表达上调,却使得Mst84Db在果蝇早期精巢中表达下调。前人的研究发现,幼虫发育期快的Wolbachia感染的雄果蝇,其引起的CI强度越高(胚胎孵化率很低),而幼虫发育期较长的Wolbachia感染雄果蝇引起的CI强度越低。由于JHI-26是保幼激素(JH)特异诱导的一种蛋白,因此Wolbachia可能模拟了JH的功能诱导了JHI-26的大量表达,高水平的JHI-26可能抑制了幼虫阶段精巢的发育,幼虫期发育最快的雄性果蝇产生了未完全成熟的精子,使得受精后雄性原核发育滞后,导致雌雄原核发育不同步,最终导致胚胎死亡。由于CG12052(lola)参与多种生物学过程,如与轴突生长和定向、免疫反应、滋养细胞凋亡、脑的形态建成、性腺的发育等有关。已有研究表明,在lola突变果蝇中,滋养细胞凋亡过程受阻,在lola突变果蝇卵巢程序性细胞死亡过程中,染色质不能完全浓缩。我们前期研究发现,在Wolbachia感染的幼虫精巢中,lola-rp基因的表达是显著下调的,因此lola-rp可能在精子发生过程中起重要作用。为了进一步分析lola-rp在果蝇发育过程中的作用,我们对下调显著的lola-rp做了时空表达分析。组织特异性分析结果显示,lola-rp在果蝇的脑和卵巢中高表达,在成体精巢中也有一定量的表达,而在幼虫阶段表达量较低,表明其可能在脑的发育以及生殖细胞的发生过程中起作用。此外,在胚胎发育过程中,从3h胚胎开始就检测到lola-rp的表达,且在整个胚胎期都维持在较高水平,说明黑腹果蝇lola-rp可能是母源性基因,且在早期胚胎发育过程中发挥重要作用。为了深入研究Mst84Db的功能,我们体外合成了Mst84Db的双链RNA,再对未感染Wolbachia雄性果蝇进行显微注射,利用RNAi技术对雄性体内Mst84Db基因的表达进行干扰。结果发现,对4-6d的雄蝇注射dsRNA后,Mst84Db基因的表达水平发生下调,在注射dsRNA24h后就起到了干扰的效果,注射后72小时,基因敲降幅度最大。与对照组相比,基因敲降后的雄蝇繁殖能力显著下降,与未感染Wolbachia的雌性果蝇交配后胚胎孵化率显著低于对照组,这与CI现象类似。另外,对未孵化胚胎的表皮进行研究发现,表皮上没有体节的出现,说明未孵化胚胎停滞于胚胎发育的早期。因此,Wolbachia感染可能抑制了精子发生过程中Mst84Db基因的转录,从而使精子正常结构和功能发生异常,最终导致与雌性果蝇交配后,胚胎发生死亡。所以我们推测Wolbachia感染导致的Mst84Db的表达下调可能是引起CI的分子机制之一。本研究不但可以为研究Wolbachia引起的CI分子机制提供新思路,而且可以为动物生殖细胞发生调控机制及共生菌与其宿主间的相互作用的研究奠定基础,在性别控制、农业害虫和媒介昆虫的生物防治等方面的应用基础研究领域,也具有潜在应用价值。