目的:针刺疗法适用于临床多种疾病,其中包括心肌缺血。大量的实验和临床研究结果表明针刺对心肌缺血具有确切的疗效和优势。以往的研究发现心肌缺血与心肌细胞钙离子通道关系密切,但对于针刺对心肌缺血钙离子通道影响的相关研究并不多见,而对于针刺作用的传入机制仍在研究之中。故本研究观察针刺内关穴对正常及特定基因敲除小鼠心肌细胞钙离子通道及其相关蛋白表达的影响,从而探讨针刺循经特异性效应对心肌缺血钙离子通道的影响以及针刺作用的传入机制,揭示经穴效应循经特异性心脏钙离子通道响应模式及特征。同时,随着人们生活节奏的加快以及竞争压力的加剧,临床上由抑郁症诱发或加重的心肌缺血发病率逐年升高,随着生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转变,抑郁症与心肌缺血在发病及治疗上的相关性受到越来越多的重视。已有研究证实抑郁症可通过下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴介导心肌缺血的发病,而针刺对抑郁症与心肌缺血均有良好的疗效,故本研究建立慢性应激抑郁大鼠模型,模拟临床抑郁症的病理表现,将心肌缺血大鼠与心肌缺血合并慢性应激抑郁大鼠进行对照,观察两种模型大鼠HPA轴相关指标含量的差异以及心肌细胞钙离子通道及其相关蛋白表达的差异,并观察针刺对两种模型大鼠HPA轴相关指标含量以及心肌细胞钙离子通道蛋白表达影响的差异,探讨慢性应激抑郁与心肌缺血在发病及治疗上的相关性,为临床治疗与抑郁症相关的心肌缺血提供指导。材料与方法:1.在研究电针内关穴对心肌缺血小鼠心肌细胞钙离子通道影响的实验中,选用24只野生C57BL/6(SPF级)小鼠和21只同品系酸敏感离子通道3(Acid-sensing Ion Channel3,ASIC3)基因敲除(ASIC3-/-)小鼠(SPF级),各自随机分为5组,分别为正常组、模型组、内关组、列缺组和非经非穴组,采用多点皮下注射异丙肾上腺素(20mg/kg)的方法建立心肌缺血模型,观察造模前,造模后,针刺后心电图ST段、T波和心率的变化;观察超声心动图心脏收缩和舒张功能相关参数变化,包括:左心室舒张末期内径(LVIDd),左心室收缩末期内径(LVIDs),舒张早期心室二尖瓣峰值速度比舒张晚期心室二尖瓣峰值速度(E/A),射血分数(EF),每搏输出量(SV)和左室短轴缩短率(FS);用光镜观察心肌组织形态变化;ELISA法检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)含量;采用Western-blot法检测钙离子通道及其相关蛋白表达,包括:钙离子通道亚基Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1以及钙调蛋白(Ca M)、钙调蛋白激酶II(Ca MKII)。2.在研究慢性应激抑郁与心肌缺血相关性的实验中,选择50只SD大鼠随机分为5组,分别为正常组、心肌缺血模型组、心肌缺血合并慢性应激抑郁模型组、内关治疗1组(内关穴治疗心肌缺血组)、内关治疗2组(内关穴治疗心肌缺血合并慢性应激抑郁组),对心肌缺血模型组和内关治疗1组采用多点皮下注射异丙肾上腺素(85mg/kg)的方法建立心肌缺血模型,对心肌缺血合并慢性应激抑郁模型组、内关治疗2组采用多点皮下注射异丙肾上腺素(85mg/kg)+强制束缚加游泳的方法建立心肌缺血合并慢性应激抑郁模型,电针内关穴治疗后,采用Western-blot法检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)蛋白表达,采用ELISA法检测血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(CORT)的含量,采用Western-blot法检测心肌细胞钙离子通道及其相关蛋白表达,包括:钙离子通道亚基Cavα1C、Cavβ、Cavα2-δ1以及钙调蛋白(Ca M)、钙调蛋白激酶II(Ca MKII)。3.结果:1.C57BL/6和ASIC3-/-两种小鼠心肌缺血后,除正常组外,其他各组小鼠心电图ST段及T波幅值均有不同程度的抬高,并且出现心率降低,与本组造模前比较均有显著性差异(P<0.01),说明小鼠心肌缺血造模成功。针刺治疗后,内关组、列缺组和非经非穴组ST段和T波幅值均出现降低趋势,各自与本组造模后比较有显著性差异(P<0.01),与模型组治疗后比较有显著性差异(P<0.01)。内关组ST段和T波降低更加明显,与列缺组和非经非穴组比较有显著性差异(P<0.01),但未恢复到正常水平。针刺治疗后,内关组、列缺组和非经非穴组心率未出现明显改变,各自与本组造模后比较无显著性差异(P>0.05)。与ASIC3-/-小鼠内关组比较,C57BL/6小鼠内关组ST段和T波幅值降低更加明显,有显著性差异(P<0.01)。2.C57BL/6和ASIC3-/-两种小鼠心肌缺血后,除正常组外,其他各组小鼠超声心动图LVIDd、LVIDs值较本组造模前均有不同程度的增加,E/A、EF、FS及SV值较本组造模前均有不同程度的降低,具有显著性差异(P<0.01),针刺治疗后,内关组、列缺组和非经非穴组LVIDd值降低,E/A升高,各自与本组造模后比较有显著性差异(P<0.01),与模型组治疗后比较有显著性差异(P<0.01)。内关组LVIDd值的降低及E/A值的升高更加明显,与列缺组和非经非穴组比较有显著性差异(P<0.01),但未恢复到正常水平。与ASIC3-/-小鼠内关组比较,C57BL/6小鼠内关组LVIDd值及E/A值的改善更加明显,有显著性差异(P<0.01)。针刺治疗后,内关组、列缺组和非经非穴组的LVIDs值、EF、FS及SV值的改善不明显,各自与本组造模后比较无显著性差异(P>0.05)。3.通过光镜检测心肌缺血心肌组织形态发现,对于C57BL/6和ASIC3-/-两种小鼠,电针内关穴、列缺穴和非经非穴均对心肌缺血两种小鼠心肌有一定的保护作用,但内关穴对两种小鼠的心肌保护作用更大。4.C57BL/6和ASIC3-/-两种小鼠心肌缺血后,与正常组比较,模型组小鼠血清CK-MB及LDH含量均有不同程度的增加(P<0.01),证实心肌缺血造模成功。C57BL/6和ASIC3-/-两种小鼠心肌缺血后,与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞钙离子通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达均有不同程度的增加(P<0.01)。针刺后,与模型组比较,内关组、列缺组和非经非穴组Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达明显降低,有显著性差异(P<0.01),内关组Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达降低更加明显,与列缺组和非经非穴组比较有显著性差异(P<0.01),但未恢复到正常水平。与ASIC3-/-小鼠内关组比较,C57BL/6小鼠内关组Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达的改善更加明显,有显著性差异(P<0.01)。5.与正常组、心肌缺血模型组以及内关治疗1组比较,心肌缺血合并慢性应激抑郁组和内关治疗2组大鼠体重增加减慢,蔗糖摄入量减少,存在显著性差异(P<0.01),提示造模方法可诱发大鼠慢性应激抑郁的发生。电针治疗第2天,电针治疗第4天,电针治疗第7天时,与心肌缺血合并慢性应激抑郁组比较,内关治疗2组大鼠体重增加加快,蔗糖摄入量增加,存在显著性差异(p<0.01)。提示电针治疗可改善慢性应激抑郁合并心肌缺血大鼠体重增加和蔗糖摄入量。与正常组比较,心肌缺血模型组和心肌缺血合并慢性应激抑郁模型组大鼠心肌细胞钙通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达均增加,存在显著性差异(P<0.01),与心肌缺血模型组比较,心肌缺血合并慢性应激抑郁模型组大鼠室旁核CRH蛋白表达,血清ACTH及CORT含量均升高,心肌细胞钙通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达均增加,存在显著性差异(P<0.01),提示慢性应激抑郁加重大鼠HPA轴功能亢进,加重心肌细胞钙离子通道蛋白表达的升高。内关穴治疗后,与心肌缺血模型组比较,内关治疗1组大鼠钙通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达降低,存在显著性差异(P<0.01);与心肌缺血合并慢性应激抑郁模型组比较,内关治疗2组CRH蛋白表达、血清ACTH及CORT含量,钙通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达降低,存在显著性差异(P<0.01)。提示:电针内关穴可明显改善心肌缺血合并慢性应激抑郁大鼠HPA轴相关指标CRH蛋白表达的升高、血清ACTH及CORT含量的升高,抑制钙通道Cavα1c、Cavβ、Cavα2-δ1、Ca M及Ca MKII蛋白表达的异常增加。结论:1.心肌缺血时,心电图、超声心动图、光镜、心肌细胞钙通道及其相关蛋白表达发生改变;针刺内关穴可改善以上相关指标。说明针刺内关穴对心肌缺血心肌细胞具有保护作用,针刺的循经特异性效应在心脏钙通道的响应模式是改善钙通道及其相关蛋白表达的异常升高,抑制钙超载。2.心肌缺血时,ASIC3基因敲除和未敲除小鼠均出现心电图、超声心动图、光镜、心肌细胞钙通道蛋白相关指标的改变,针刺内关穴可改善两种小鼠以上相关指标,对于ASIC3基因未敲除小鼠改善作用大于对ASIC3基因敲除小鼠的改善作用,说明针刺作用的传入途径可能是激活ASIC3受体离子通道,进而抑制交感神经,从而改善异丙肾上腺素兴奋交感神经后引起的心肌缺血。3.心肌缺血合并慢性应激抑郁的心肌细胞钙离子通道蛋白表达明显高于心肌缺血的钙通道蛋白表达,说明慢性应激抑郁加重心肌缺血损伤,心肌缺血与慢性应激抑郁在发病上具有相关性。电针内关穴可改善心肌缺血大鼠及心肌缺血合并慢性应激抑郁大鼠HPA轴亢进和心肌细胞钙离子通道表达,说明内关穴既可以治疗心肌缺血,又可以治疗慢性应激抑郁,两病均可以用内关穴进行治疗,提示心肌缺血与慢性应激抑郁在治疗上具有相关性。4.以上结论证实经穴-脏腑相关,慢性应激抑郁-心肌缺血相关,为经穴-脏腑相关性及抑郁症与心肌缺血相关性提供理论依据。