越来越多的实验证据表明，糖尿病血管并发症发病的关键部位在于血管内皮细胞及其下层的血管平滑肌细胞，而既作为物理性屏障结构又是内分泌活跃的组织机构--内皮细胞，在糖尿病高血糖的病理状态下极易受到损伤而发生一系列的连锁病理反应，这是造成血管并发症的重要环节。实验证实，高浓度葡萄糖在作用早期以剂量依赖性和时间依赖性方式诱导大血管和微血管内皮细胞发生凋亡和坏死。长期的高血糖症是视网膜微血管糖尿病相关性损伤和糖尿病性视网膜病发展中的中心促发因素，视网膜毛细血管内皮细胞直接暴露于血浆中，内皮细胞被高血糖损伤以及随之发生的血-视网膜屏障被打破可能是目前已知糖尿病性视网膜病的早期原因。当前已明确内皮细胞的功能障碍可能促进异常血管生长，但在糖尿病中高血糖引起内皮细胞功能障碍的分子调节机制不甚明确，高血糖是否通过破坏血管增生因子表达，特别是通过改变血管内皮生长因子VEGF的表达，从而引起血管内皮功能的障碍尚不清楚。以血管增生相关因子为靶点正成为治疗糖尿病血管并发症等血管增生性疾病的研究热点，作为血管生长因子中的代表性因子VEGF，探讨其在高糖病理状态下的表达及其作用机制，对于全面认识糖尿病血管并发症具有重要意义。 研究目的: 本研究主要探讨高糖病理状态下血管因子VEGF表达失调及在高糖诱导内皮细胞凋亡中作用分子机制： 1.证实高糖具有诱导内皮细胞凋亡的作用；阐明高糖诱导内皮细胞凋亡的分子机制，即通过激活线粒体凋亡通路、活性氧损伤和钙超载等分子机制诱导内皮细胞凋亡。 2.验证高糖作用于血管内皮细胞时，血管增生刺激因子VEGF下调规律；明确VEGF下调在高糖诱导内皮细胞凋亡中发挥关键作用，上调VEGF可抑制高糖诱导内皮细胞凋亡。 3.探讨VEGF下调的分子机制，阐明高糖下调VEGF的分子机制与ERK1/2MAPK密切相关，提出高糖下调VEGF可能通过抑制ERKMAPK存活信号通路起作用。 主要研究内容和结果: 第1章高糖诱导内皮细胞凋亡模型的建立及验证。 1.1高糖诱导毛细血管内皮细胞HRCEC及大血管内皮细胞HUVEC凋亡。TUNEL(原位末端标记)对高糖处理的HRCEC内皮细胞染色结果显示，TUNEL阳性信号为呈现棕黄色或黄色荧光，位于胞核，呈圆形、环行或颗粒状，证实高糖可诱导毛细血管内皮细胞凋亡。Hoechst染色后在蓝色荧光下显示，Hoechst阳性信号为胞核呈现明亮染色区，流式细胞术AnnexinV/PI双染法定量检测高糖作用于HUVEC内皮细胞后凋亡率为(14.1±3.3)％，显著高于正常组(3.3±0.44)％的凋亡率。表明高浓度葡萄糖能诱导血管内皮细胞发生凋亡，导致内皮细胞功能紊乱。 第2章高糖诱导内皮细胞凋亡中VEGF的表达改变及调控。 2.1高糖下调内皮细胞VEGF表达。RT-PCR半定量分析显示，内皮细胞经高糖处理后的早期阶段，VEGFmRNA表达量随糖浓度升高而下降，糖浓度从15mM升高到25mM，VEGFmRNA分别是正常时的65％和40％；Westernblotting半定量分析表明，VEGF蛋白分别是正常时的83％和45％。与正常糖浓度(5mM)处理相比，无论是mRNA水甲还是蛋白水甲，二者均具有显著性变化。按时间点变化，VEGF蛋白在6h开始表达下降。 2.2VEGF拮抗高糖对p42/44MAPK活性的下调作用。Westernblotting分析P42/44MAPK活性显示，p42/44MAPK活性随时间有所改变，高糖作用后p42/44MAPK活性短时间(15min)内显著下降，随着时间延长，活性逐渐恢复。外源性VEGF蛋白加入高糖处理组中，可以拮抗高糖对P42/44MAPK活性的下调作用，表明VEGF对内皮细胞增殖信号分子有促进作用，可以拮抗高糖早期对内皮细胞的损伤作用。 2.3抑制p42/44MAPK活性可以下调VEGF。采用p42/44MAPK特异性抑制剂PD98059阻断p42/44MAPK活性后，观察VEGF表达改变，发现阻断p42/44MAPK活性后，VEGF的表达也明显受到抑制。 第3章高糖下调VEGF的分子机制。 3.1VEGF拮抗高糖上调Bax/Bcl-2比值、激活Caspase3切割的作用。Westernblotting结果显示，高糖呈时间依赖性上调促凋亡蛋白Bax表达，在24h表达具有显著性差别。而外源性VEGF可以拮抗高糖诱导的Bax/Bcl-2比值上调效应。同样采用Westernblotting分析，结果也表明，高糖作用于内皮细胞一段时间后(12h以上)，可以激活凋亡蛋白酶Caspase3的切割活性，并且随着作用时间延长，切割产物更为明显。而外源性VEGF可以抑制Caspase3的切割活性，使切割产物减少。说明VEGF对高糖诱导的内皮细胞凋亡具有保护性分子水平反应。 3.2VEGF拮抗高糖诱发的内皮细胞ROS产生和钙离子内流。通过Fenton反应显示，高糖可以促进胞内ROS产生增加，而外源性VEGF可以抑制ROS产生过多。Fluo-3荧光染料分析显示，赢糖作用内皮细胞后，胞内钙离子浓度[Ca2+]i升高，说明高糖可以促进钙离子内流，而VEGF可以抑制这一过程发生。 结论: 在高糖诱导内皮细胞凋亡中，高糖直接作用于内皮细胞早期导致VEGF下调，可能是高糖导致内皮细胞功能紊乱的重要机制。由于高糖诱导内皮细胞可缘于VEGF缺乏，通过补充外源性VEGF因子后内皮细胞的凋亡效应缓解，Bax/Bcl-2比值下降，凋亡蛋白酶切割活性受抑制，细胞内导致凋亡的因素得以改善甚至被清除，由此证实VEGF下调在高糖致内皮细胞凋亡中起核心作用。