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牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin,LFB)是一种由牛乳铁蛋白在酸性条件下水解产生的活性肽,因携带8个正电荷与携带大量负电荷的癌细胞具有很强的选择性结合能力。牛乳铁蛋白肽在发挥抗肿瘤活性的浓度范围内对正常细胞几乎没有毒性,但对很多肿瘤细胞系具有毒性。本研究目的是验证LFB对肝细胞癌是否具有选择性毒作用并研究其在体外对Bel-7402和Huh-7细胞产生抗癌活性的机制,为LFB具有抗肝细胞癌活性及作用机制提供参考依据。使用人工合成的牛乳铁蛋白肽,通过CCK-8法检测LFB对肝癌细胞Huh-7、Bel-7402和人正常肝细胞QSG-7701、L02的毒作用,以作用浓度0、0.2 mg/m L、0.4 mg/m L、0.8 mg/m L、1.6 mg/m L和3.2mg/m L的LFB处理四种细胞;采用细胞平板克隆实验以未处理的Huh-7和Bel-7402作为空白对照组,以浓度0.6 mg/m L、0.8 mg/m L和1.0 mg/m L的LFB处理作为实验组,分别测定LFB对Huh-7和Bel-7402细胞的增殖抑制率;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术分析不同浓度的LFB作用于Huh-7和Bel-7402细胞后,细胞周期比例的变化规律。结果显示,LFB对Bel-7402和Huh-7产生细胞毒性且呈现时间和浓度依赖性,同浓度对QSG-7701、L02处理72 h时毒性并不显著;对Huh-7和Bel-7402细胞增殖的抑制率随着LFB浓度的增加而增大。说明LFB可选择性的对肝癌细胞Bel-7402和Huh-7产生毒性而在此浓度范围对正常肝细胞并无明显毒性,且通过浓度依赖性的方式诱导Bel-7402和Huh-7细胞阻滞S期并抑制其增殖活力。通过Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术分析LFB对Huh-7和Bel-7402细胞凋亡率的影响;利用荧光倒置显微镜观察LFB浓度分别为0、0.6 mg/m L、0.8 mg/m L和1.0 mg/m L时作用于Huh-7和Bel-7402细胞24 h后细胞内的活性氧浓度、线粒体膜电位变化并通过试剂盒检测细胞内MDA和SOD水平变化;用5 m M的NAC提前处理细胞2 h再用LFB处理细胞比较与LFB处理组的细胞凋亡率,验证LFB诱导的细胞凋亡是否由细胞内ROS的升高造成。结果显示,随着LFB浓度的升高,Huh-7和Bel-7402细胞内的活性氧浓度逐渐升高,相应的两种细胞的线粒体膜电位呈下降趋势。细胞内的MDA含量上升,SOD含量下降,说明LFB可能通过活性氧介导的线粒体途径诱导Huh-7和Bel-7402细胞凋亡。流式细胞术观察结果,显示NAC+LFB组Huh-7和Bel-7402细胞的凋亡率要低于LFB单独处理组,说明降低细胞内活性氧浓度可以抑制LFB诱导的Bel-7402和Huh-7细胞凋亡。研究表明LFB通过激活活性氧介导的线粒体凋亡途经诱导Bel-7402和Huh-7细胞凋亡。通过RT-PCR和Western blot从转录和翻译两个层面验证LFB产生抗肿瘤活性的机制。结果显示,Huh-7和Bel-7402细胞内促凋亡蛋白Bax、Cytochrome c、Cleaved-PARP含量上升,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降,且在m RNA和蛋白质水平呈现相同的结果;周期调控蛋白Cyclin E、CDK2表达量下降;增殖标志物PCNA和JAK2/STAT3通路中调节因子p-STAT3,p-JAK2含量下降,说明LFB通过降低CDK2-cyclin E复合物表达和抑制JAK2/STAT3通路的激活抑制细胞增殖。研究表明,LFB通过上调Bax、Cytochrome c、Cleaved-PARP的m RNA和蛋白质含量,降低Bcl-2m RNA和蛋白质含量激活活性氧介导的线粒体凋亡途经诱导Bel-7402和Huh-7细胞凋亡,并通过降低CDK2-cyclin E复合物浓度和抑制JAK2/STAT3通路抑制其增殖活力。