研究背景瘢痕(Scar)是创伤愈合时皮肤的自然修复反应,但其异常增生则导致病理性瘢痕。瘢痕按照临床表现与病理类型的不同,常分为瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、浅表性瘢痕、萎缩性瘢痕四类,临床上以增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)最为常见,约占91.4%,虽然它的增生范围局限于伤区之内,但它不仅严重影响着外观,其挛缩又可导致功能障碍,这为瘢痕患者带来了经济和心理的负担。但目前其形成机制不清楚,自然也无确切治疗方法。近几年研究人员在HS的形成与消退的机理方面取得了丰厚的成果。细胞分子生物学上公认理论为:①成纤维细胞(Fb)是增生性瘢痕的主要效应细胞,正是Fb分裂失控与功能异常,导致其数目增多,胶原纤维过度分泌,造成HS细胞外基质过度沉积,但是Ⅰ型胶原纤维(CollagenⅠ)与Ⅲ型胶原纤维(CollagenⅢ)却始终维持在一个较为恒定比值,即2:1;②与形态结构与物质层面上它主要表现为胶原纤维的代谢紊乱,形态不一,大小不一,排列紊乱,在不同时期其对应的表现也往往不同;影响瘢痕中Fb的增殖与分泌功能的因素有很多,其中神经因素所起作用越来越受重视,主流看法是:③神经生长因子(NGF)表现为两面性,一方面低浓度的NGF在某些因子的影响下只能与Tr KA结合,进而活化NF-KB通路,使成纤维细胞增殖及活化。另一方面,恰恰相反,高浓度的NGF却能P53结合,进而通过JNK-BAX通路促进细胞的凋亡。④神经肽P物质(SP)能结合NK-2受体进而激活调节蛋白B-catenin导致表皮干细胞向成纤维细胞迁移、分化。⑤成纤维细胞还有其自身的正反馈调节机制,即在外源性SP下又能自分泌SP。在创面修复中Fb占主导地位,它的异常直接导致HS形成。成纤维细胞的过度增殖与胶原纤维的过量分泌,直接造成细胞外间质过多沉积,导致修复的创面过度愈合,一般认为其中的Ⅰ,Ⅲ型胶原纤维比例发生变化是其特征,其中增生型瘢痕为2:1,瘢痕疙瘩为19:1,这是瘢痕形成的重要机制之一。简而言之,瘢痕是多种因素,多种信号分子的相互异常,造成成纤维细胞的异常而导致的。近年研究表明神经因素在其中发挥了重要作用,有人证实神经肽(SP)受体对成纤维细胞(Fb)增殖起起调控作用,一方面神经末梢分泌的SP能作用于瘢痕成纤维细胞,导致成纤维细胞自分泌SP,这也是正反馈调节FB增殖的机制之一;另一方面增多的SP和SP受体在创伤愈合早期又能够积极促进Fb的增殖;但当创伤修复完成时,此过程并未停止,仍在继续,所以它伴随着瘢痕形成的整个过程。但是随着神经因素在瘢痕影响方面的研究深入,关于对SP在增生性瘢痕发挥作用的机制的认识并不完善,相关理论也并不全面,并不能全面解释增生性瘢痕的所有特点。所以有必要对SP在瘢痕中发挥作用的影响因子及调节机制做进一步研究。外周神经纤维再构筑是增生性瘢痕瘢痕形成的重要过程之一。Zhang LQ,Laato M等学者研究证实在创伤愈合过程中损伤的神经纤维的再构筑伴随着创伤修复的全过程,其中非正常愈合的瘢痕中神经纤维数量比正常愈合的皮肤多。而Altun V的对于早期瘢痕的研究报道表明形成时间不同的增生性瘢痕其神经纤维数量也明显不一样,其数量是随着时间延长而增加的,但其数目是低于正常皮肤的。但是在增生性瘢痕修复过程中,关于中晚期的瘢痕损伤的神经重构的研究却鲜有报道,对其分泌的神经肽(SP)与神经生长因子(NGF)的变化特征认识也并不十分完善。因此需要进一步研究不同时期增生性瘢痕中神经构筑与其分泌的神经因子的间规律。神经的构筑与微循环的重构是增生性瘢痕形成的重要基础,神经末梢分泌的SP及NGF能调节胶原的代谢,活化免疫细胞,而且对神经纤维与毛细血管的修复与再生起着重要作用。而增生性瘢痕的微循环的重建是通过神经肽P物质(SP)、降钙基因相关肽(CGRP)、血管活性肽(VIP)等均可刺激血管内皮细胞的增殖而来。Evans AR研究表明SP可增强血管内皮细胞中NO合成酶活性,上调血管内皮细胞的增殖效应。同时CGRP又能通过结合内皮细胞特异性受体,增加血管内皮细胞数量及DNA合成。与此同时Rayehaudhuri SK研究证实NGF又作用于真皮微小血管内皮细胞(HDMEC),使其增殖。因此可推测正常皮肤微血管数目少于增生性瘢痕中微血管数目,但不同时期增生性瘢痕中神经肽SP与神经生长因子NGF含量差异性较大,因此对于神经因素在HS微血管中扮演的角色仍需要进一步探索。增生性瘢痕的患者中部分临床变现为局部瘙痒,灼痛,在进食辛辣刺激物时症状加重。O’Connor TM研究表明SP在依赖浓度下能刺激免疫细胞如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞分泌免疫因子,介导免疫反应,进而使微小静脉渗出血浆,同时能协同CGRP扩张小动脉产生皮肤红肿。Danzani C证实P物质既趋化多种炎症细胞,又能使肥大细胞脱颗粒,释放组胺,进而导致外周敏化。近年来有学者证实神经纤维再生不全也是瘢痕形成中重要一环,在该情况下,靶细胞持续合成大量NGF并维持较高水平,并趋化炎性细胞,释放大量细胞因子和炎症介质,产生疼痛或瘙痒。由此可见神经肽SP与神经生长因子NGF是导致增生性瘢痕灼痛的重要物质基础,在此过程中亦发挥着协同作用。也许因此近年来有不少学者在主张临床上使用类固醇激素或是抗组胺药物、神经毒素等治疗伴有瘙痒或灼痛的增生性瘢痕,也取得了一定的效果,但是对于此类治疗的作用的具体机制,针对此类瘢痕的使用的条件,使用时机把握并不准确,使用安全性方面也存在争议,因此疗效与使用范围上也打了折扣,因此探索SP与NGF在增生性瘢痕形成过程的相互作用规律,作用机制有着重要的临床指导及科研意义。虽然针对HS发病机制的研究所取得成果显著,但对于治疗尚缺有效手段,目前外科手术仍然是HS的主要治疗手段。许多临床工作者单从手术方法上改进,有的通过“Z”“S”“W”成形局部减张,有的沿皮纹方向做切口,有的只切除瘢痕纤维部分而保留外层皮肤,但并不是从瘢痕本质入手,所以效果并不理想,部分患者由于再次手术创伤导致后期瘢痕进一步增大。本实验标本均经临床医生鉴定为增生性瘢痕,皆采用手术方法切除获得。大量的研究表明神经类毒素,如肉毒素A对增生性瘢痕预防及治疗均有明显效果,但对于其作用机理并不十分清楚。所以研发调控成纤维细胞凋亡的治疗方法而成为防治瘢痕形成的关键。本实验通过收集不同时间,不同程度的增生性瘢痕,通过免疫组化、免疫荧光、计算机分析、Westernbolt,ELISH,RT-PCR,MTT,流式细胞术等方法,观察其中神经构筑规律,分析SP与NGF分布及含量,进行生物学的鉴定。首次通过加入不同浓度SP、NGF,模拟不同时间,不同程度HS中成纤维细胞的环境,探讨SP与NGF的相互作用机制,在不同环境下对HS形成的影响进行研究,从蛋白及基因水平找出其规律,为HS机制的阐明与机制提供思路。并探讨肉毒素A对HS的Fb凋亡及相关蛋白的影响,期望找到其针对早期HS效果显著的理论依据。研究目的1、认识神经生长因子NGF与神经肽SP在正常皮肤组织与增生性瘢痕组织中病理学及分子学上的差异。2、明确SP与NGF在增生性瘢痕成纤维细胞增殖及活化过程中的相关性、探索成纤维细胞增殖、活化的影响,并初步从分子水平阐述其可能机制。3、探索肉毒素A(BTXA)对HS中Fb生长凋亡及相关蛋白的影响,推测其形成可能机制,为临床上应用BTXA治疗提供理论依据。研究方法1、标本收集收集标本均来自广东省第二人民医院标本取自我院,从2013-03至2015-01的30名创伤瘢痕患者的30例标本,实验前经过广东省第二人民医院伦理委员会批准,所有实验标本均在取标本时告知患者相关伦理委员会要求,并取得患者的签字同意书。实验过程中严格按照《中国实验伦理标准》进行。标本入选与排除标准:A、经专业医生鉴定所取标本为增生性瘢痕(HS)。B、所有患者既往均无慢性病史及皮肤病史,术前半年无瘢痕药物治疗史。2、标本的处理及其分组干燥冷藏法保存切取得样本,4小时内进行实验。样本分三部分处理:第一部分用10%福尔马林甲醛溶液固定,用于形态学鉴定,如免疫荧光、Masson染色、伊红苏木素染色、免疫组化等;第二部分用于原代细胞培养;第三部分冻存备用(弥补前面部分实验的失误或者提取蛋白和RNA用于后续实验)3、应用Masson、HE染色从不同角度行形态学观察,比较不同时期,不同严重程度增生性瘢痕组织与正常皮肤组织结构层次差异性。4、应用免疫组织化学技术对SP,NGF,CollagenⅠ,CollagenⅢ进行染色,观察其在瘢痕组织内分布的特点,并用图像分析仪计算相对表达量。5、应用组织微粒法原代培养成纤维细胞,观察其生长规律与特征,并为后续实验的进行做准备。6、应用PCR检测加药组与未加药组增生性瘢痕中组织成纤维细胞的胶原I,胶原III,SP,NGF基因的表达情况,并与正常的组织中Fb行比较,分析其差异性,应用WB技术检测I及III型胶原在瘢痕组织内Fb的表达,应用ELISH检测SP及NGF在瘢痕组织Fb内的表达。7、使用MTT法检测加入SP、NGF、以及NF-KB通路特异性阻滞剂PDTC后成纤维细胞增殖情况,绘制增殖率曲线图,分析各组差异性。8、应用流式术检测梯度浓度肉毒素A对增生型瘢痕成纤维细胞的凋亡影响。半定量RT-PCR检测细胞中CollagenⅠ与CollagenⅢm RNA的表达情况;研究结果1、瘢痕成纤维细胞形态学观察与鉴定(1)接种HS的组织微粒一周后,见少量细胞从组织周围爬出,有些呈涡旋状,有些呈放射状(图2-1a)。原代Fb多为梭形或不规则三角形,胞质向外伸出,长短不一,多为涡旋状、放射状。部分细胞交叉重叠,呈团块样。(2)生长曲线显示:HS的FB接种后经过1周左右潜伏期即开始进入对数期快速增长,约12天后进入停滞期。(图2-1b)。2、瘢痕组织的HE染色结果观察(1)正常皮肤结构层次清楚,表皮薄,形状多变且较扭曲,厚度变化较大。从基底层向上到角质层各层细胞逐渐扁平,各层结构完整,形态正常,排列整齐,角质层较薄,基底层可见正常数量的黑色素细胞,表皮钉脚较多,且深入真皮组织中。真皮中可见与表皮交界部位的乳头层和其下的网织层,乳头层含有较多的细胞成分,网织层则以胶原纤维为主,胶原纤维粗细均匀,呈螺旋状,并可见神经、血管、毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肽附属器(图1-2a)。(2)早期6个月以内HS表皮较薄,表皮整体厚度较正常的比较均一,变化不大,但表皮各层细胞从下往上细胞渐变扁平,已丧失其应有的正常形态,成分也不完整,表皮钉角消失,部分细胞或组织,如基底层的黑色素细胞,颗粒层与棘层,减少或消失,并在真皮可见大量增粗无序的胶原纤维(图1-2b)。(3)中期7-18个月HS表皮明显增厚,高于正常,总体仍是从下往上细胞逐渐扁平,细胞成分也不完整,已丧失应有的正常形态,真皮可见乳头层和网织层,但乳头层的乳头数量要少于正常皮肤的,其下可见增生的微小血管与触觉小体(感觉神经末梢结构),其网织层的胶原纤维粗大,排列杂乱(图1-2c);(4)晚期18个月以上HS表皮角质层与正常皮肤相比由薄变厚再基本恢复正常,但基底层黑色素细胞明显多于正常皮肤,其网织层的胶原纤维变细,排列杂乱,稀疏,毛囊,汗腺,皮脂腺数量较少(图1-2d)。3、masson染色观察:不同程度的HS,以Masson染色差异性并不十分明显,其共同特征是真皮层内胶原纤维含量大,粗细不等,胶原纤维排列不规则评分较研究结果高的于乳头层可见血管增生数目较多(图1-3a);评分较低网状层胶原纤维排列紧凑,越靠近表皮则越不规整,越近皮下则排列较规整,评分较高的缩榨倾向的微血管数目较多(图1-3b),部分胶原纤维交叉形成胶原结节,以近乳头层明显(图1-3c)。4、IHC结果:(1)CollagenⅠ与CollagenⅢ的免疫组化染色显示:HS中I型胶原主要分布于真皮网状层,粗大,大部分呈交织结节状(图1-6a)。III型胶原散在分布于真皮的胞间质,乳头层染色较深,较细,排列疏松,互相交织走行方向不一。于成纤维细胞、微型血管壁、神经感受器周围均有I与III型胶原纤维的分布(图1-6b)。(2)SP的免疫组化染色显示:HS中的SP大量分布在微血管周围、神经末梢,肥大细胞、多核白细胞、成纤维细胞以及皮肤附件周围。而正常皮肤中SP的表达主要在肥大细胞、神经末梢、汗腺与微血管周围,成纤维细胞的分布并不明显。中期染色最深,镜下直视观早期及晚期差异不明显,但仍高于正常;通过图像分析仪定量分析显示:HS中早、中期SP的含量随时间延长而增多,但晚期逐渐降低,但仍高于正常皮肤(图,表1-5)。5、RT-q PCR结果显示:按照表达量的从高到低依次为高浓度SP低浓度NGF,高浓度SP与PDTC、低浓度SP、低浓度SP与PDTC、低浓度NGF与PDTC、高浓度NGF、高浓度NGF与PDTC。(如图2-4)。6、Western Blot显示:加入肉毒素A、SP与PDTC、低浓度NGF与PDTC的实验组中成纤维细胞中I与III型胶原纤维的蛋白表达明显低于未加药组,且与添加剂量呈负相关;而加入SP与低浓度NGF组成纤维细胞中I与III型胶原蛋白表达高于未加药组。SP与PDTC组、高浓度NGF实验组对比空白组差异性不明显(如图2-5,3-1),7、ELISH显示:加入各药物实验组与未加药物组比较,加入外源性低浓度SP,低浓度SP与PDTC,高浓度SP,高浓度SP与PDTC,低浓度NGF,低浓度NGF与PDTC,高浓度NGF,成纤维细胞分泌的目标蛋白SP与NGF分别符合拟合方程SP:y=2.17577/1+(x/73.69503)-1.89890+0.17747;NGF:y=2.07606/1+(x/91.90703)-2.06979+0.11774标准曲线的拟合度非常好(R值分别为0.99522,0.99895),(其中X值表示加药浓度,Y值表示OD值)。(图2-3)。8、SP作用前后细胞形态结构未见明显变化,而高浓度NGF作用后可见大部细胞漂浮坏死,部分细胞形状扁平,过度伸展,伸展末端细长有分支。与对照组相比SP对体外培养的Fb生长增殖具有明显促进作用。结合曲线可知,随着SP剂量的增加对促进Fb增殖趋近平稳。(图2-2)。9、流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测FB凋亡情况显示:加入BTXA瘢痕成纤维细胞凋亡率为12.213±0.89667,未加组瘢痕成纤维细胞凋亡率为2.032±0.95673,相比具有统计学意义(图、表3-2)。结论1、本研究通过瘢痕成纤维细胞的原代与传代培养,可观察到加入SP、NGF、肉毒素A后增生性瘢痕成纤维细胞形态、结构相比空白对照组无明显改变。2、增生性瘢痕组织中CollagenⅠ与CollagenⅢ明显增加,SP,NGF含量也较正常组织高。3、增生性瘢痕的成纤维细胞在外源性SP的作用下能自分泌SP,为正反馈调节纤维细胞增殖机制之一。而外源性SP在增生性瘢痕中可以调节NGF的产生,并通过NF-KB通路发挥协同作用,能够促进成纤维细胞的过度增殖,病理性胶原I,III的过度代谢。4、肉毒素A能够促进成纤维细胞的凋亡,并可抑制SP物质的形成,进而通过抑制NF-KB通路抑制成纤维细胞的活性,导致Collagn I与Collagen III的表达下调。