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酸黄瓜Cucumis hystrix Chakr.(2n=24)是葫芦科甜瓜属珍贵的野生种质资源,是迄今为止唯一能够与黄瓜Cucumis sativus L.(2n=14)成功杂交可育的近缘野生种,具有栽培黄瓜所急需的耐低温弱光,高抗霜霉病、蔓枯病、根结线虫等优良性状。为了在实现酸黄瓜和栽培黄瓜成功杂交的基础上,利用黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料,精细定位和图位克隆酸黄瓜中的优异抗霜霉病、蔓枯病、根结线虫等基因/QTL,本实验室成功构建了酸黄瓜基因组BAC文库,并保存于96孔细胞培养板中。戊糖磷酸途径(Oxidative Pentose Phosphate Pathway, OPPP)是调控植物正常生长发育,响应不同的环境胁迫,提高植物抗性的重要代谢途径。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase, G6PDH, EC1.1.1.49)催化OPPP途径的第一步反应并生成NADPH,是该途径的关键限速酶。鉴于G6PDH在OPPP途径中的重要作用,进行G6PDH基因的克隆并将为利用遗传工程方法调控该基因的表达,达到促进植物对逆境胁迫的响应和提高胁迫抗性奠定基础。本论文以甜瓜属酸黄瓜为材料,基于其基因组BAC文库进行G6PDH基因的克隆相关研究,具体研究内容及结果如下：1.酸黄瓜BAC文库PCR筛选体系的构建本实验挑取酸黄瓜基因组BAC文库单克隆并保存于96孔细胞培养板中,对该文库的457个96孔培养板进行接种,培养,一级池和二级池的池化(pooling),提取了文库混合池的BAC质粒DNA,建立了文库的PCR筛选体系。其中一级池46个(每个池包含10个培养板的960个BAC克隆),二级池457个(每个池由1个培养板的96个BAC克隆混合而成)。一级池得到约50-100ng·μL-1的BAC质粒DNA200μL,二级池100μL。按每个PCR反应15μL体系计算,可以进行至少1000-2000个反应,为进行大量的BAC的筛选工作做好了充分的准备。2.酸黄瓜葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因保守区克隆与BAC文库PCR筛选在构建酸黄瓜BAC文库筛选体系的基础上,即可对感兴趣的基因进行筛选。利用GenBank已报道植物G6PDH的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR技术,从酸黄瓜中克隆得到长度为807bp的G6PDH基因mRNA特异片段。在NCBI上在线Blast检索,发现该片段序列与其他植物G6PDH基因具有较高的同源性,表明所扩增的片段为酸黄瓜G6PDH基因片段。根据该保守序列设计特异引物,利用酸黄瓜BAC文库筛选体系进行筛选,获得了173-8F和237-1F2个BAC阳性单克隆。3.酸黄瓜葡萄糖-6磷酸脱氢酶基因序列及其启动子结构分析选取173-8F克隆测序,拼接后获得了酸黄瓜G6PDH基因全序列及上游启动子序列,并提交GenBank,登录号：JQ771576。基因的序列分析显示：G6PDH基因全长约6.5kb,由15个外显子和14个内含子组成。内含子序列均符合5’-gt-ag-3’结构。外显子拼接后获得了G6PDH基因的开放阅读框(ORF)序列,序列全长1551bp,编码516个氨基酸,与黄瓜G6PDH基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.71%和99.03%。酸黄瓜G6PDH氨基酸序列N端缺少转运肽序列,确定为酸黄瓜胞质G6PDH。氨基酸序列与烟草、马铃薯、荷兰芹、猕猴桃、拟南芥、大豆、小麦、玉米、葡萄、杨树等植物胞质G6PDH同源性高达77%以上。系统发育树分析发现,甜瓜属胞质G6PDH与茄科植物最先聚类,植物胞质G6PDH在分子进化水平上与物种进化相符。启动子结构分析表明：序列含有启动子基本元件TATA-box、CAAT-box,还含有丰富的光响应元件及与环境胁迫响应相关的不同元件,以及促进高水平转录的5UTR Py-rich stretch元件,提高表达的CAT-box元件等。