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随着科学技术的不断发展,糖的功能性得到了越来越深入的研究与开发,各种功能性糖在食品、医药等行业应用越来越广泛。在传统的生产方式中各种功能性糖主要是化学合成。但是化学合成方法制取工艺复杂、生产成本高且容易造成环境污染。这些因素制约了功能性糖产业的进一步发展。而运用现代生物技术生产功能性糖具有易操作、成本低、反应特异性好、反应条件温和、产物纯、产量高等优势。所以具有很大的发展潜力。在运用现代生物技术生产功能性糖的过程中核苷酸糖是必需的糖供体底物。而核苷酸糖的生产依赖于具有高性能的生物酶。UDP-半乳糖(UDP-Gal)和UDP-木糖(UDP-Xyl)是两种重要的核苷酸糖,在功能性糖的合成中起着重要作用,但难以获得价格昂贵。UDP-葡萄糖(UDP-Glc)容易获得且比较廉价,UDP-半乳糖和UDP-木糖都可以以UDP-葡萄糖为底物通过相关酶制取。UDP-葡萄糖4-表异构酶(UGE)能够把UDP-葡萄糖异构为UDP-半乳糖。UDP-葡萄糖脱氢酶(UGD)能够催化UDP-葡萄糖脱氢生成UDP-葡萄糖醛酸,而UDP-木糖合成酶(UXS)能够继续催化UDP-葡萄糖醛酸脱羧生成UDP-木糖。本论文以这三种酶为研究对象,从太平洋牡蛎基因组中挖掘这三种酶基因(CGIUGE、CGIUGD和CGIUXS),进行克隆、表达及酶学研究。研究发现来源于太平洋牡蛎的这三种酶催化效率都比较高,且反应条件都比较温和,适合于UDP-半乳糖和UDP-木糖的生产应用。尤其是CGIUGE酶催化能力很强,稳定性也好,具有很大的开发潜力。本论文同时也对一釜多酶法合成UDP-木糖进行了研究,并成功获得了产物且转化率较高。具体研究成果如下:1.CGIUGE、CGIUGD与CGIUXS的克隆表达、序列分析及酶蛋白表达纯化。根据已知的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)基因组序列,可以初步确认该生物的基因组中有一个UGE基因、一个UGD基因和一个UXS基因,分别将它们命名为CGIUGE、CGIUGD和CGIUXS。从新鲜太平洋牡蛎中提取RNA,然后反转录制取cDNA,再以cDNA为模板,对这三个基因进行克隆,构建重组表达载体,将重组表达载体导入到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中。氨基酸序列分析表明CGIUGE、CGIUGD基因与其它真核生物同源基因序列间有很高的保守性,部分序列相似度可达60%以上,但和原核生物保守性不高。CGIUXS酶与前两个酶相比,CGIUXS与已发现的同功酶的保守性明显要低,暗示本研究所得到的UXS酶具有独特酶学特性的可能。CGIUGE、CGIUGD和CGIUXS在大肠杆菌BL-21菌株体外表达和纯化后经SDS-PAGE电泳检测,均得到了与理论值大小相同的条带。2.原核重组表达CGIUGE的酶活鉴定及酶学特性研究建立了一个新的对UGE这类异构酶进行活性鉴定的方法,并在此基础上对UGE这类异构酶的酶学特性检测方法进行了研究。酶活鉴定结果表明,CGIUGE酶具有活性,且活性很强。酶学特性检测结果表明,重组的CGIUGE的最适pH值为8.5,最适反应温度为25℃,16℃和37℃也有较强的活性。不需要金属离子作为辅酶。Ni2+对CGIUGE的酶活性有较强的促进作用,Cu2+、Mn2+和Zn2+能够抑制CGIUGE的酶活性,而Ca2+、Co2+、Fe3+和Mg2+对CGIUGE没有明显的影响。随着浓度的升高,w-ME、Urea、Imidazole和SDS均可使CGIUGE的酶活性降低,且SDS使CGIUGE的酶活性降低的最为明显。CGIUGE在37℃和42℃下较为稳定,但在50℃和60℃时易失活。CGIUGE对UDP-半乳糖的Km值为21μmol/L,最大反应速率为 19μmol/L/min。Kcat值为 0.039min-1。3.原核重组表达CGIUGD和CGIUXS的酶活鉴定及酶学特性研究用UPLC对酶催化反应产物分析结果发现CGIUGD催化UDP-葡萄糖生成了 UDP-葡萄糖醛酸,CGIUXS催化UDP-葡萄糖醛酸生成了 UDP-木糖。这说明CGIUGD和CGIUXS也都有活性。用MALDI-TOF进一步验证了 CGIUGD和CGIUXS的反应产物UDP-葡萄糖醛酸和UDP-木糖。酶学特性检测结果表明,重组的CGIUGD的最适pH值为9.0,最适反应温度为37℃,不需要金属离子作为辅酶。Co2+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能够抑制CGIUGD的酶活性,而Ca2+、Mg2+、Mn2+和Ni2+对CGIUGD均没有明显的影响。在一定浓度范围内β-ME可使CGIUGD的活性增强,且在β-ME浓度为10 mM时活性最强。当Urea的浓度较低时可使CGIUGD的活性增强,而随着浓度的升高Urea又开始抑制CGIUGD的酶活性。Imidazole作用于CGIUGD的效果和Urea相似,不过没有Urea那么显著。不同浓度的Triton-X100对CGIUGD的酶活性影响不大。SDS可显著抑制CGIUGD的酶活性,且浓度越高抑制越强烈。CGIUGD在37℃下较为稳定,但在42℃、50℃和60℃时易失活。UDP-木糖可以对CGIUGD产生反馈抑制作用。CGIUGD对UDP-葡萄糖的Km值为20 μmol/L,最大反应速率为34μmol/L/min,Kcat值为0.505 min-1。CGIUGD对NAD+的Km值为54μmol/L,最大反应速率为22 μmol/L/min,Kcat值为0.653 min-1。酶学特性检测结果表明,重组的CGIUXS的最适反应pH为7.5,最适反应温度为37℃,不需要金属离子作为辅酶。Co2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Zn2+均可增强CGIUXS的酶活性,尤其Mn2+增强效果最显著。而Ca2+、Fe2+和Ni2+对酶活性没有明显影响。在一定浓度范围内β-ME可使CGIUXS的活性增强,且在β-ME浓度为10 mM时活性最强。Urea能够抑制CGIUXS的酶活性,且浓度越高,抑制能力越强。Imidazole对CGIUXS的酶活性影响不大。在一定浓度范围内Triton-X100可以增强CGIUXS的酶活性,且在这个范围内浓度越高,增强效果越强。CGIUGE在37℃和42℃下较为稳定,但在50℃和60℃时易失活。CGIUXS对其底物UDP-葡萄糖醛酸的Km值为28μmol/L,最大反应速率为 16 μmol/L/min,Kcat值为 0.014min-1。4.一釜法合成UDP-木糖CGIUGD和CGIUXS在一釜法试验中成功催化UDP-葡萄糖生成UDP-木糖,单因素试验中CGIUGD和CGIUXS的最佳用量比为2:5,反应最适pH为8.0,最适温度为37℃,正交试验获得的最佳反应条件组合为pH7.5,37℃,酶量比为2:5。在此条件下UDP-木糖产率为72.681%。三种因素中温度对反应影响最大,酶量比次之。在此正交试验的基础上反应体系从20μL扩大至1mL,UDP-木糖的产率从72.681%变为69.721%,变化不大。表明该方法具有应用于实际生产的潜力。