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目的：犬传染性肝炎（ICH）是由犬腺病毒Ⅰ型（CAV-1）引起的一种急性败血性传染病。该病以1岁以内的幼犬为多发，发病率和死亡率相对较高，对我国实验犬的饲养、毛皮动物养殖业造成较大的经济损失。目前主要通过定期接种弱毒疫苗预防本病发生，但是弱毒疫苗存在毒力回升、生产成本较高、终生需要定期免疫的缺点。本研究将Loop基因克隆到真核表达载体pVAX1，构建核酸疫苗pVAX1-Loop，用RT-PCR的方法检测Loop基因的表达，用Western blotting和激光扫描共聚焦显微镜鉴定Loop蛋白的表达，用重组质粒pVAX1-Loop免疫BALB/c小鼠，并检测其诱导小鼠产生的细胞及体液免疫效果。
方法：⑴提取犬腺病毒的DNA，以其为模板扩增Loop1和Loop2片段，同时通过引物设计在Loop1片段两端引入BamHⅠ、SmaⅠ酶切位点，在Loop2片段两端引入SmaⅠ、XhoⅠ酶切位点。将Loop1和Loop2的PCR产物回收后用SmaⅠ进行酶切，纯化，将纯化后片段在16℃进行连接。⑵重组质粒的大量提取取真核重组质粒阳性克隆重组菌接种于2×YT液体培养基振荡培养36h；离心收集细菌沉淀。采用SDS-碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1-Loop。⑶ELISA测定血清抗体效价免疫3次后的小鼠断尾采血，分离血清，以犬传染性肝炎病毒抗原每孔100μg/ml包被酶标板，4℃过夜。洗涤封闭后加稀释的小鼠血清100μl，孵育60min后洗涤加HRP标记的二抗孵育60min，OPD显色。酶标仪492nm波长处测吸光度值。
结果：①目的基因与真核表达载体经酶切及PCR鉴定，构建成功。②pVAX1-Loop转染B16细胞后，用RT-PCR的方法检测到预期的特异性条带。③pVAX1-Loop转染B16细胞后，激光扫描共聚焦显微镜下观察到表达蛋白显著的荧光强度。④pVAX1-Loop转染B16细胞后，Western blotting结果显示表达蛋白与抗Loop抗体有特异性结合。⑤间接ELISA检测显示，各实验组小鼠所产生的抗体血清OD值明显高于注射空质粒pVAX1的对照组A组（P<0.05）。⑥免疫小鼠脾淋巴细胞经流式细胞分析，各实验组小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞构成比均高于注射空质粒pVAX1的对照组A组（P<0.05）。⑦采用MTT法检测脾淋巴细胞增殖活性，各实验组小鼠淋巴细胞增殖活性均高于注射空质粒pVAX1对照组A组（P<0.05）。
结论：⑴成功构建真核表达载体pVAX1-Loop。⑵pVAX1-Loop转染B16细胞后能够表达Loop蛋白。⑶pVAX1-Loop免疫BALB/c小鼠，成功诱导小鼠产生了特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。