肝癌是全球最常见和死亡率最高的恶性肿瘤之一:其中,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型,占所有肝脏肿瘤病例的70～90%。由于肝细胞癌的发病机制较为复杂,目前为止其临床治疗的效果仍不理想。临床上发现的早期HCC患者,一般可以采取手术切除的治疗方法,而且能够达到一定的治疗效果。但是在多数病例中,HCC的诊断往往是晚期,肿瘤切除及肝移植已经不是治疗的可选方案,只能采取放疗、化疗、肝动脉化疗栓塞或靶向治疗等方法。HCC对目前常用到的放化疗并不敏感,索拉非尼(sorafenib)靶向治疗是晚期HCC治疗的首选方案。然而,索拉非尼靶向治疗也存在诸多问题和局限,例如临床存用药指征不明与细胞耐药性高发的问题。因此,HCC晚期患者的治疗效果也非常有限,并使得HCC预后差与复发率高的现状未得到根本性的改观。深入研究HCC的发生发展与耐药机制、寻找新药物及通过新的药物联用机制杀伤肿瘤细胞具有重要意义,且在新药研发中更具独特的优势和潜力。近年来,细胞衰老成为一种针对肿瘤细胞永久性生长的治疗肿瘤新途径而受到研究者的关注。肿瘤细胞经化疗后可能走向不同的结局,包括经典类型的细胞死亡—细胞凋亡和坏死,或者是细胞衰老。细胞衰老,口前被认为是细胞脱离了细胞周期、并不可逆地失去了细胞增殖的能力之后从而进入的一种相对稳定的状态。研究表明,细胞衰老不同于细胞凋亡,表现在衰老的细胞仍然具有生存活力和代谢活性,但失去了增殖的潜能及DNA合成和进一步细胞分裂的能力。衰老细胞呈现出许多典型特征,包括细胞周期阻滞、衰老标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性的增强,同时伴随着独有的衰老细胞形态学改变即细胞变得大而扁平,以及衰老相关分泌表型和分子生物标志物的表达变化。细胞衰老可由多种应激因素引起,如端粒功能障碍、DNA损伤、ROS和染色质异常等。目前的研究已表明,细胞衰老在生物体内可发挥抗癌防线的重要作用。作为一种新型的抗肿瘤策略,细胞衰老在多方面发挥积极效应,尤其是细胞衰老能在药物浓度明显低于传统治疗浓度的情况下被诱导,从而为降低药物毒性提供了可能性并能够为已对凋亡产生抗性的细胞提供新的靶标。因此,通过化学治疗药物诱导肿瘤细胞发生衰老,已成为抗肿瘤研究的一个研发热点。从天然资源这个巨大的宝库中寻找高药效、低毒性,并具有多机制抗肿瘤活性的新型天然药物为恶性肿瘤的治疗提供了新的途径。天然化合物来源丰富,结构与活性多样,其中传统中草药中诸多活性成分更是为抗肿瘤、抗耐药及化疗联用策略的新发现提供了新思路。中药小分子,是一类从天然产物中分离纯化而得到的具有特定生物活性的天然小分子化合物;而中药小分子的挖掘与发现主要依靠药物活性与药效的筛选。因此,本论文基于天然小分子在抗肿瘤方面的潜在优势,并根据国内外相关文献,对传统中药乳香(Boswellia serrata)和淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)中的多种三萜类、黄酮类天然小分子是否具有诱导细胞衰老的生物活性进行了筛选,发现来源于乳香的乙酰基-11-羰基-β-乳香酸(acetyl-1 1-keto-β-boswellic acid,AKBA)与来源于淫羊藿的淫羊藿素(icaritin,ICT),能够通过诱导肝细胞癌细胞发生衰老而发挥抗肿瘤作用,并对其分子机制进行了深入探讨;同时,基于肝细胞癌对索拉非尼耐药问题及化疗策略的局限性,本论文进一步对两种天然小分子抗耐药细胞的作用进行了研究,从而为肝细胞癌新型治疗策略的发现与临床应用奠定基础。第一部分中药小分子抗肝细胞癌活性与诱导细胞衰老活性筛选实验目的:结合国内外文献的相关报导,对中药乳香和淫羊藿中的已知小分子活性成分的进行筛选,进一步寻找具有抗HCC活性且能够诱导细胞衰老活性的潜在化合物,并对其药理学活性进行详细的研究。实验方法:1.通过MTT法检测多种天然小分子对不同HCC细胞的增殖抑制作用,评估其体外抗HCC活性;对筛选出的目标化合物的作用浓度与作用时间进行范围扩展,进一步研究其作用特点;同时利用细胞克隆形成实验,进一步明确化合物对细胞增殖的影响。2.通过SA-β-Gal染色及细胞形态的变化分析细胞衰老,明确目标化合物的细胞衰老诱导活性及最佳作用浓度。3.通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,分析不同浓度的化合物对细胞凋亡的影响。4.通过流式细胞术的实验方法,检测目标化合物对细胞周期的影响。5.通过5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxyuridin,BrdU)掺入实验,明确目标化合物对细胞DN A合成的影响。6.通过western blotting、qRT-PCR检测细胞周期调控因子、炎症因子的表达变化。实验结果:1.首次确定乳香活性成分AKB A与淫羊藿活性成分ICT对HCC细胞均具有显著的增殖抑制作用和诱导细胞衰老活性。2.阐明了AKBA与ICT在较低浓度下即可诱导细胞衰老的发生,而未引发明显的细胞凋亡。3.明确了AKBA与ICT分别在3-5μM、1-2μM的作用浓度下,诱导衰老的作用较为显著;在此浓度下,二者均可导致细胞发生G0/G1细胞周期阻滞,抑制细胞克隆形成,且阻断D N A合成,从而进一步证实其诱导衰老活性。结论:经药物活性筛选,首次发现并明确了中药天然小分子AKBA与ICT的诱导细胞衰老活性,提示二者具有不同于凋亡的的抗肿瘤机制,从而为AKBA与ICT的进一步推广研究并成为一种新型的抗HCC药物提供了理论依据。第二部分中药小分子acetyl-11-keto-β-boswellic acid与icaritin通过诱导细胞衰老抗肝细胞癌的机制研究与体内活性分析实验目的:基于第一部分的化合物筛选结果,继续展开深入研究,探讨AKBA和ICT的诱导细胞衰老的调控机制及其在动物体内的诱导肿瘤细胞衰老活性。实验方法:1.通过γH2AX的免疫荧光与western blotting分析低浓度AKBA和ICT对DNA损伤的影响。2.通过western blotting、qRT-PCR检测DNA损伤、DNA修复及细胞周期调控相关基因、蛋白的表达变化。3.通过流式细胞术,明确化合物对胞内ROS生成的影响。4.利用siRNA进行p21CIP1基因敲除,分析p53/p21CIP1对AKBA诱导衰老的影响。5.N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)预处理细胞以抑制ROS产生,分析ROS对ICT诱导DNA损伤及细胞衰老的影响。6.HepG2细胞接种于裸鼠皮下,构建HCC动物模型并给药,通过检测肿瘤生长明确体内抗HCC作用;并通过SA-β-Gal染色及细胞形态的变化分析在体内是否能够诱导HCC细胞产生细胞衰老,通过免疫荧光分析关键蛋白的表达变化。实验结果:1.免疫荧光与western blotting实验结果显示,低浓度AKBA能够明显引起yH2AX荧光斑点的形成和累积,γH2AX蛋白表达显著上调,说明低浓度AKBA诱导细胞发生DNA损伤;同时,AKBA能够显著抑制多种DNA损伤修复基因的表达,涉及多个DNA损伤修复通路,包括同源重组和非同源末端连接(如RAD51、RAD51AP1、RPA1、XRCC2、XRCC5、XRCC6、FEN1),错配修复(如MSH2、MSH6、EXO1),以及核苷酸切除修复(如DDB1、ERCC1、GTF2H3、RPA1)。以上结果说明,AKBA能够引起DNA损伤并同时抑制DNA修复,从而诱导细胞衰老。进一步分析AKBA诱导细胞衰老的信号机制,发现DNA损伤下游信号p53/p21CIP1发挥关键作用,利用siRNA敲低p21CIP1的表达,AKBA诱导细胞衰老的活性明显降低。以上结果表明,AKBA诱导DNA损伤并抑制DNA修复,激活p53/p21CIP1通路,从而导致细胞周期阻滞,细胞失去增殖能力而发生细胞衰老。动物实验结果表明,AKBA显著抑制肿瘤生长,而体重无明显变化。AKBA处理组的SA-β-Gal染色阳性率显著增加,γH2AX蛋白表达增加,p53/p21CIP1信号通路激活。说明AKBA在动物体内同样能够通过DNA损伤和p53/p21CIP1活化而诱导细胞衰老。2.流式细胞术结果显示,低浓度的ICT处理HCC细胞后,ROS生成显著增加,1μM和2μM ICT分别使ROS增加30%和80%。γH2AX荧光斑点形成和蛋白表达分析表明,ICT引起的ROS过量生成进一步导致DNA损伤应答反应。NAC预处理细胞以消除ROS后,ICT介导的γH2AX表达和SA-β-Gal染色阳性率显著降低,证实ICT诱导的ROS过量生成和随后的DNA损伤引起HCC细胞的衰老。结论:AKBA与ICT具有显著的诱导细胞衰老的作用,其调控机制均与DNA损伤相关但存在差异:AKBA通过诱导DNA损伤并抑制DNA修复,激活p53/p21CIP1通路,从而导致细胞周期阻滞,细胞失去增殖能力而发生细胞衰老;ICT通过刺激ROS过量产生诱导DNA损伤并导致细胞衰老的发生。以上提示AKBA与ICT作为衰老诱导药物应用于HCC临床治疗的可能性和发展潜力。第三部分中药小分-子acetyl-11-keto-β-boswellic acid与icaritin抑制肝细胞癌耐药细胞的作用与机制研究实验目的:通过索拉非尼耐药细胞模型的构建,阐明AKBA与ICT的抗耐药细胞活性并对其作用机制进行探讨。实验方法:1.通过MTT检测细胞增殖。2.通过Transwell检测细胞侵袭。3.通过SA-β-Gal染色及细胞形态的变化分析细胞衰老状态。4.通过细胞微球形成实验、干细胞相关基因表示分析耐药细胞的干细胞表型。5.通过ROS水平、超氧阴离子水平与谷胱甘肽还原型/氧化型比率明确细胞的氧化还原状态。6.通过转染表达质粒,明确AKBA、ICT影响的关键信号蛋白。实验结果:1.通过对HCC细胞发生耐药过程中的分子事件追踪与相关调控信号分析,发现HCC细胞在索拉非尼持续筛选过程中发生细胞衰老的逃逸,逃逸细胞不断增殖而形成稳定增值的群落,并最终发展为耐药细胞Huh7/Sor。Huh7/Sor除具有耐药、侵袭性强等表型外,其肿瘤干细胞样特性尤为显著;JAK/STAT3和PI3K/AKT显著活化。同时,耐药细胞呈ROS低水平,GSH/GSSG比率明显上调。2.AKBA和ICT对耐药细胞具有抑制活性。具体机制研究发现AKBA和ICT能够抑制其干细胞表型,并同样能够诱导细胞衰老的发生。二者的干性抑制活性通过微球形成实验、干性基因表达分析予以证实;进一步信号调控机制分析明确了AKBA和ICT影响干性与耐药的主要信号通路JAK/STAT3和P13K/AKT。两种化合物均可诱发耐药细胞发生细胞衰老。结论:AKBA和ICT对HCC耐药细胞具有抑制活性,且通过抑制其干细胞表型并诱导细胞衰老的发挥抗耐药细胞作用。上述发现进一步扩展了 AKBA与ICT的潜在用药范围,为其应用于耐药性HCC或与其他化疗药物联用提供了理论和物质基础。