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疫苗免疫是预防动物疾病的主要措施,但免疫过程中因接种方式、次数、免疫应激等因素造成机体免疫器官受损,导致疫苗免疫后未能起到有效的免疫保护。疫苗佐剂是解决上述问题的有效手段。研究发现人参皂苷具有很高的保健和药用价值,并具有免疫调节和抗炎等作用,而且能够显著提高体液免疫应答和细胞免疫答应。因此,本研究把人参皂苷Rb1作为新的佐剂成分,以鸡传染性法氏囊（IBD）弱毒疫苗为研究对象,通过体内外试验研究人参皂苷Rb1作为免疫佐剂发挥免疫增强作用。在此基础上,研究了人参皂苷Rb1调控IL-4（白介素-4）对鸡IBD疫苗的免疫增强作用。此外,为提高生物利用度,本研究将人参皂苷Rb1包裹于磷酸钙纳米粒中,制备成人参皂苷Rb1磷酸钙纳米粒进一步探讨了其对鸡IBD疫苗的免疫增强作用及其作用机理。主要研究内容与结果如下:1.人参皂苷Rb1体外安全性评价为研究人参皂苷Rb1在体外安全使用浓度。本试验将不同浓度的人参皂苷Rb1单独或者与鸡IBD弱毒疫苗同时加入鸡脾淋巴细胞中,采用CCK-8法检测经Con A和LPS刺激后鸡脾淋巴细胞增殖的影响。结果显示,与对照组相比,人参皂苷Rb1单独或者与鸡IBD弱毒疫苗同时加入浓度在1.5625μg/m L、3.125μg/m L、6.25μg/m L时,鸡脾淋巴细胞增殖能力相对较强,初步说明人参皂苷Rb1对鸡脾细胞的安全浓度使用浓度为1.5625μg/m L-6.25μg/m L。2.人参皂苷Rb1对鸡IBD弱毒疫苗增强作用为了研究人参皂苷Rb1对鸡IBD疫苗是否具有免疫增强作用,本试验将SPF鸡随机分为7组,用不用剂量的人参皂苷Rb1（0.5 mg/kg BW、1mg/kg BW、2mg/kg BW）分别与鸡IBD弱毒疫苗进行免疫。联合免疫后第7d、14d、21d,使用ELISA方法检测血清中IBDV特异性抗体的滴度和IL-6、IFN-γ、IL-4等细胞因子表达水平;在同一时间点,无菌分离脾淋巴细胞、脾脏及法氏囊,用CCK-8和RT-q PCR法检测脾脏淋巴细胞增殖水平和组织中免疫相关分子m RNA的表达水平。最后,在免疫后28d通过滴鼻方式攻毒进行保护效率评价。ELISA结果显示,与对照组相比,不同剂量的人参皂苷Rb1均能显著提高鸡血清中抗IBDV特异性抗体滴度和细胞因子水平（P＜0.01）;CCK-8检测免疫后脾淋巴细胞的增殖水平,结果显示,不同剂量的人参皂苷Rb1与鸡IBD弱毒疫苗免疫后鸡脾淋巴细胞增殖能力显著高于对照组（P＜0.01）。RT-q PCR结果显示,人参皂苷Rb1均显著上调了鸡脾脏和法氏囊组织中CD40、CD80、CD86、MHCII、TGF-β、TNF-α、IL-6和IL-4基因的m RNA表达水平。免疫力评价结果显示:人参皂苷Rb1能提升IBD弱毒疫苗的保护效率。3.人参皂苷Rb1对鸡IBD弱毒疫苗免疫后的肠道粘膜免疫增强作用为了研究人参皂苷Rb1是否能增强鸡IBD疫苗的肠道粘膜免疫效果,本试验分别在免疫后7d,用RT-q PCR法检测十二指肠组织中粘膜免疫相关分子的m RNA表达水平;在免疫后7d、14d、21d,取十二指肠做石蜡切片,免疫组化试验观察固有层Ig A+细胞和肠上皮内淋巴细胞IELs数目。使用ELISA方法检测同时间点收集的肠内灌洗液中特异性s Ig A、总s Ig A表达含量。结果显示,人参皂苷Rb1显著上调了鸡肠组织中CD40、CD80、CD86、MHCII、TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-4、plg R、Ig A、和CCR-9等m RNA的表达水平（P＜0.01）;ELISA和免疫组化结果显示,口服人参皂苷Rb1显著提高了肠道中总s Ig A和特异性s Ig A的含量,同时固有层Ig A+细胞和十二指肠粘膜IELs的数量也显著增加（P＜0.01）。4.人参皂苷Rb1协同IL-4对鸡IBD弱毒疫苗的免疫增强作用为了进一步研究人参皂苷Rb1协同IL-4对鸡IBD弱毒疫苗免疫增强效果,本试验将SPF鸡随机进行分组,用人参皂苷Rb1/IL-4与鸡IBD弱毒疫苗进行免疫。在免疫后7d、14d、21d、28d、42d,采用ELISA法进行检测血清中特异性抗体、抗体亚型Ig G2a、Ig G1水平和细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ水平;同时无菌分离脾脏淋巴细胞和鸡骨髓源树突状细胞,检测鸡树突状细胞表面分子表达情况和脾脏淋巴细胞增殖水平。结果显示,与对照组相比,人参皂苷Rb1/IL-4与鸡IBD弱毒疫苗组显著提高了鸡血清中抗IBDV特异性抗体及抗体亚型滴度和细胞因子水平（P＜0.01）。同时能显著增强鸡脾淋巴细胞增殖反应（P＜0.01）,提高了树突状细胞表面分子CD80和MHCII的表达量。5.人参皂苷Rb1磷酸钙纳米粒对鸡IBD弱毒疫苗免疫增强效果研究由于人参皂苷Rb1具有体内代谢快、作用时间短等不足,为提高其生物利用度,得到稳定性高和免疫原性好的人参皂苷Rb1纳米粒,本试验将Rb1/IL-4包裹于磷酸钙纳米粒中制备成人参皂苷Rb1/IL-4磷酸钙纳米粒（GRb1/IL-4@CS/Ca P）,并对其进行表征。然后,进一步评价其对鸡IBD弱毒疫苗的免疫增强作用。20日龄收集鸡股骨制备骨髓源细胞,用流式细胞仪检测骨髓源树突状细胞表面分子MHCII、CD80的表达情况和细胞因子TNF-α、IL-1β分泌水平;免疫后28d、42d,采用ELISA方法检测血清中特异性抗体Ig G及抗体亚型Ig G2a、Ig G1滴度和细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-4分泌水平。在免疫后的7d、14d、21d,取十二指肠做石蜡切片,观察固有层Ig A+细胞和肠上皮内淋巴细胞IELs数目。同时间点收集肠内灌洗液及十二指肠组织,采用ELISA方法检测十二指肠肠道中总s Ig A、特异性s Ig A的含量;RT-q PCR法检测组织中m RNA的表达水平。纳米颗粒表征结果显示:GRb1/IL-4@CS/Ca P在冷冻扫描镜下观察呈不规则的类似花状立方体结构,纳米粒径由原来的3121nm±72.46nm增加到4265nm±72.92nm,电势由原来的+6.87±0.27降到-22.71±0.89,纳米粒的PDI值和zeta电位值在28 d内未发现明显变化,且PDI＜0.3。ELISA检测结果表明:GRb1/IL-4@CS/Ca P能显著提高IBDV特异性抗体Ig G及抗体亚型Ig G2a、Ig G1抗体水平和细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-4水平（P＜0.01）,且包封后更有效地促进鸡骨髓源树突状细胞的成熟和细胞因子分泌。此外,GRb1/IL-4@CS/Ca P组还可提高肠道中总s Ig A和特异性s Ig A的含量,上皮固有层的Ig A+细胞数量和十二指肠粘膜IELs数量也呈现升高趋势;鸡十二指肠组织中相关免疫调节基因CD40、CD80、CD86、MHCII、TGF-β、TNF-α、IL-4、IL-6、plg R、Ig A和CCR9的m RNA表达水平显著上调（P＜0.01）。综上所述,人参皂苷Rb1可显著提高血清中的特异性抗体水平和细胞因子的表达水平,增强脾脏淋巴细胞增殖反应,显著提高脾脏、法氏囊和十二指肠组织中免疫相关基因的m RNA表达水平,且口服人参皂苷Rb1可显著提高肠道IELs细胞和固有层Ig A的分泌量,从而提高肠道黏膜免疫。初步说明了人参皂苷具有免疫增强作用。此外,人参皂苷Rb1协同IL-4使用和Rb1/IL-4包裹于磷酸钙纳米粒中制备成人参皂苷Rb1/IL-4磷酸钙纳米粒可作为免疫增强剂提高机体体液免疫应答反应,有效促进细胞因子的分泌和骨髓源树突状细胞的成熟,显著提高肠道IELs细胞和固有层Ig A+的分泌量及十二指肠组织中免疫相关基因m RNA表达水平,进一步验证对鸡IBD疫苗具有免疫增强作用。上述研究表明:人参皂苷Rb1具有开发为一种新型免疫佐剂的潜力。