背景：近年来基因治疗已经成为恶性肿瘤治疗研究中的热点。已有研究通过将治疗基因靶向地导入肿瘤细胞内来达到治疗恶性肿瘤的目的，取得了一些进展。然而，目前困扰基因治疗的主要瓶颈问题之一仍是缺乏安全、有效和稳定的基因体内传输系统，常用的基因传输载体主要由病毒类载体及非病毒类载体两类组成。非病毒载体主要有脂质体、质粒等，其优点为具有良好的安全性能，但是同时存在转染效率低的缺点，严重影响了基因治疗的效果。病毒类载体例如慢病毒及腺病毒，虽然有较高的转染效率，但是其具有一定的毒性和免疫原性等缺点，临床应用一直受到限制。因此构建一种安全性能好、转染效率高的新型基因载体对基因治疗具有极其重要的意义。超声辐照联合微泡介导的基因转染(ultrasound and microbubble-mediated gene transfection，UMGT)是近年来发展起来的一种新型转染技术，其中超声微泡作为携载基因的载体，具有安全、便捷、稳定、高效等特点，不过目前的研究显示，超声微泡在携载治疗基因、避免体内吞噬、防止体内治疗基因被降解以及自身粒径等方面仍存在着诸多不足。前列腺癌的有效治疗一直是目前临床治疗的难点，特别是雄激素非依赖性前列腺癌(androgen independent prostate cancer，AIPC)，我们在前期研究中应用多聚赖氨酸法制备了携载ARsiRNA的纳米泡，并在体外实验中证实其能联合超声辐照，将ARsiRNA有效转染至C4-2细胞(AIPC细胞)，抑制AIPC细胞的生长。但我们的研究同时发现，多聚赖氨酸法是将带有负电荷的超声微泡与带有正电荷的多聚赖氨酸结合使微泡表面带有正电荷，从而能与带有负电荷的siRNA结合，实现在微泡上携载基因的目的，此种方法属于一种间接静电吸附法，携载siRNA的稳定性较差，虽然在体外实验中抑制AIPC细胞生长的效果较好，但是要在体内应用必须在前期研究的基础上开发和制备一种纳米泡，其表面直接携带正电荷，从而能够高效、直接地与治疗基因(DNA、siRNA和质粒)结合，解决超声微泡携载治疗基因稳定性差的缺点，从而实现在体内联合超声辐照能够抑制AIPC移植瘤生长的作用。目的：结合上述研究进展和我们前期研究结果，本研究拟制备一种新型的阳离子纳米泡，研究其在体外和体内的超声物理特性与超声造影特点。探讨该阳离子纳米泡与不同治疗基因(siRNA、质粒、抗体)的结合能力。同时针对难治性的AIPC，制备出携载ARsiRNA的纳米泡，检测ARsiRNA的携载量，并以AIPC细胞及其移植瘤为研究对象，分别研究携载ARsiRNA的阳离子纳米泡联合超声辐照对AIPC细胞和移植瘤生长的影响，进一步观察超声辐照后细胞及移植瘤细胞膜微观结构的变化规律，为纳米泡作为基因载体联合超声辐照治疗肿瘤提供详实的实验依据和研究基础。方法：1.将鱼精蛋白与其他脂质成分按照一定比例混合，运用冷冻干燥及机械振动法制备新型阳离子纳米泡，检测制备的纳米泡的粒径、表面电荷、浓度及其稳定性。与微米泡SonoVue相比较，运用Philips iu22超声诊断仪在体外和体内实验中分别检测纳米泡的物理特性和超声造影特点。2.检测阳离子纳米泡的生物安全性，通过荧光显微镜观察阳离子纳米泡携载siRNA、质粒、抗体的能力，同时通过分光标度仪检测阳离子纳米泡的载ARsiRNA量，在体外实验中转染AIPC细胞(C4-2)，并与脂质体相比较，运用CCK-8检测两种不同转染方法抑制C4-2细胞生长的能力。3.通过不同分组检测载ARsiRNA的纳米泡联合超声辐照抑制裸鼠AIPC移植瘤生长的能力，通过qRT-PCR及WB检测处理后移植瘤ARmRNA及AR蛋白的表达水平，同时通过扫描电镜观察超声辐照后AIPC细胞及其移植瘤细胞膜表面的变化。结果：1.本实验制备的阳离子纳米泡形态规则、分布均匀、无明显聚集，平均粒径(521.2±37.57)nm，平均浓度为(1.2±0.37)x108/ml，表面Zeta电位(18.5±5.13)mv，阳离子纳米泡的粒径和表面电荷在制备一周内保持稳定。阳离子纳米泡在体内外实验中都有明显的造影效果，与SonoVue相比，其在开始显影时间、峰值强度等造影参数方面没有明显差别，在移植瘤以及裸鼠肝肾的超声造影持续时间明显长于后者。阳离子纳米泡在裸鼠肝脏、肾脏和前列腺癌移植瘤中增强显影的持续时间约20min，且在移植瘤显影中阳离子纳米泡的分布更为广泛，能够在微米级微泡不能显影的肿瘤中心区域显影。2.荧光显微镜下发现鱼精蛋白阳离子纳米泡可以有效携载siRNA、质粒、抗体，并能有效转染肿瘤细胞、原代细胞及干细胞。其中，载Cy3ARsiRNA的阳离子纳米泡在镜下发出红色的荧光，部分呈“指环状”；其最大基因携载量约为(15-16)μg/108个纳米泡；载ARsiRNA的阳离子纳米泡联合超声辐照可以有效转染C4-2细胞，CCK-8生长曲线显示，与传统的脂质体转染方法相比，前者的细胞生长抑制率明显高于脂质体(P<0.05)。3.载ARsiRNA的阳离子纳米泡联合超声辐照可以抑制裸鼠AIPC移植瘤的生长，移植瘤的AR蛋白及ARmRNA的表达水平明显降低，同时接受治疗后的移植瘤冰冻切片荧光显微镜结果显示，Cy3ARsiRNA可以穿透血管进入移植瘤组织；扫描电镜发现无论是体外细胞还是移植瘤实体细胞，其细胞膜表面均有孔道形成。结论：1.鱼精蛋白阳离子纳米泡大小一致、分布均匀，表面带有正电荷，稳定性能好，具有良好的体外和体内超声造影效果。2.鱼精蛋白阳离子纳米泡可以有效携载不同的治疗基因(siRNA、质粒、抗体)，体外实验中联合超声辐照可以有效转染多种不同细胞，针对AIPC细胞，载ARsiRNA的阳离子纳米泡联合超声辐照能有效抑制AIPC细胞的生长。3.载ARsiRNA阳离子纳米泡联合超声辐照可以使AIPC移植瘤的AR蛋白质及ARmRNA的表达受到抑制，从而达到有效抑制AIPC移植瘤生长的效果。超微形态学观察证实，载ARsiRNA阳离子纳米泡联合超声辐照处理后，AIPC细胞及其移植瘤细胞膜上有明显的孔道形成，表明载ARsiRNA的阳离子纳米泡联合超声辐照有助于增加细胞膜的通透性。