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多穗柯(Lithocarpus polystachyrus Rehd)，又名甜茶，是一种壳斗科石柯属的常绿乔木，广泛的分布于我国南方大部分区域。因其具有清热解毒和降压安神等功效而受到人们的亲睐。三叶苷(Trilobatin)是一种大量分布于多穗柯中的二氢查耳酮类化合物，在嫩叶中的含量很高，高达10%以上。Trilobatin不仅是多穗柯中甜味剂的主要成分，也是多穗柯的主要活性成分之一，对Trilobatin研究有助于在医药食品等领域的开拓，具有重要的研究价值。对乙酰氨基酚(APAP)是一种广泛使用的非处方镇痛药，可缓解疼痛和发烧。但是，过量的APAP可能导致严重的肝损伤。顺铂(Cisplatin，CDDP)，为目前临床上最常用的抗肿瘤药物之一，广泛用于治疗多种肿瘤。但是CDDP的使用伴随严重的不良反应，从而限制它的临床应用，尤其是肾毒性。近年来研究表明，很多中药提取成分对CDDP导致肾损伤具有保护效果。
为深入探究甜茶提取物和Trilobatin对药物致小鼠肝肾损伤的保护作用，本文首先探讨了不同乙醇浓度和料液比对多穗柯嫩叶Trilobatin提取率产生的影响，并对其中的Trilobatin进行提取，分离制备。进而，通过构建APAP致小鼠肝损伤模型和CDDP致小鼠肾损伤动物模型，对多穗柯提取物及Trilobatin对药源性肝肾损伤保护作用及潜在分子机制进行探究。本文主要取得了如下三方面的结果：
1、多穗柯Trilobatin提取分离及制备的研究
通过考察不同乙醇浓度，料液比等因素对Trilobatin提取率的影响，综合实验结果得出影响顺序为：乙醇浓度＞料液比，从而确定在乙醇浓度为70%，料液比为1∶30时，三叶苷提取率最高。利用最佳提取条件所得样品，对其中的Trilobatin进行分离，70%乙醇超声提取多穗柯嫩叶，得到的Trilobatin粗提物经AB-8大孔树脂富集，50%洗脱液过硅胶柱，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱液梯度洗脱，得到高纯度富含三叶苷样品的甜茶提取物(STL-E)，作为后续药理实验的样品备用。通过半制备HPLC对三叶苷进行分离制备，共得到2种主要的单体化合物，化合物Ⅰ鉴定为根皮苷，共21mg，；化合物Ⅱ鉴定为三叶苷，共320mg，纯度均≥98%。
2、STL-E对APAP致小鼠肝损伤的保护作用与作用机制
通过构建APAP肝损伤小鼠模型并对小鼠血清进行生理指标的测定发现：单次注射APAP能够导致小鼠血清中ALT，AST及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平急剧升高，经过STL-E的给药显著降低了这些细胞因子和酶的水平。STL-E在50和100mg/kg剂量预给药7天能够显著抑制小鼠肝脏中GSH的过度耗竭，并降低了MDA的水平。通过组织病理学检查和TUNEL染色发现，STL-E治疗显著改善了APAP诱导的肝细胞凋亡。此外，免疫荧光染色显示，与小鼠APAP组相比，经STL-E处理的肝组织中TNF-α标记的肝细胞减少。我们通过Western印迹分析评估了PI3K/Akt信号通路的蛋白表达及其下游蛋白的表达情况发现，APAP导致肝细胞中Bcl-2表达降低而Bax、Caspase9和Caspase3表达增加，并且PI3K/Akt信号通路中的相关蛋白表达受到抑制，STL-E预处理后相关蛋白活性得到恢复。此外，结果表明STL-E通过抑制IKKα，IKKβ和IκBα的活化来抑制NF-κB的活化。总之，本研究发现：STL-E可能部分通过参与调节PI3K/Akt信号通路及其介导的NF-κB信号通路，缓解了APAP诱导的肝损伤。
3、Trilobatin对CDDP小鼠急性肾损伤的保护作用与作用机制
基于STL-E拮抗APAP肝毒性的有益效果，本部分通过构建CDDP肾损伤小鼠模型继续探讨其主要活性成分——三叶苷Trilobatin的肾保护作用与分子机制。结果表明：与CDDP组比价，Trilobatin在50和100mg/kg剂量下给药10天能够明显降低CRE、BUN和MDA水平。同时，通过TUNEL和免疫荧光染色来观察肾脏组织的病理变化，结果表明：Trilobatin给药组可以有效改善CDDP导致的肾组织细胞的坏死和凋亡等情况的发生。重要的是，我们通过对MAPK通路相关蛋白进行Westernblot分析，其结果表明，CDDP给药后p-JNK、p-ErK、p-38等蛋白表达明显增加，而Trilonatin给药能逆转这一现象也证实上述研究结果。综上，本研究发现：Trilobatin可以有效改善CDDP给药后MAPK信号通路相关蛋白p-JNK、p-ErK、p-38等蛋白表达，从而拮抗肾细胞凋亡。
综上所述，本论文通过研究多穗柯中Trilobatin的分离纯化得到富含Trilobatin的STL-E和单体化合物，为后续药理实验提供了物质保证。此外我们通过研究STL-E对APAP肝损伤小鼠保护作用及Trilobatin对CDDP诱导的肾损伤的相关分子机制发现，其机制可能涉及缓解氧化应激、减少炎症反应及抑制细胞凋亡等方面，为Trilobatin及多穗柯的后续药理活性的研究奠定基础。
为深入探究甜茶提取物和Trilobatin对药物致小鼠肝肾损伤的保护作用，本文首先探讨了不同乙醇浓度和料液比对多穗柯嫩叶Trilobatin提取率产生的影响，并对其中的Trilobatin进行提取，分离制备。进而，通过构建APAP致小鼠肝损伤模型和CDDP致小鼠肾损伤动物模型，对多穗柯提取物及Trilobatin对药源性肝肾损伤保护作用及潜在分子机制进行探究。本文主要取得了如下三方面的结果：
1、多穗柯Trilobatin提取分离及制备的研究
通过考察不同乙醇浓度，料液比等因素对Trilobatin提取率的影响，综合实验结果得出影响顺序为：乙醇浓度＞料液比，从而确定在乙醇浓度为70%，料液比为1∶30时，三叶苷提取率最高。利用最佳提取条件所得样品，对其中的Trilobatin进行分离，70%乙醇超声提取多穗柯嫩叶，得到的Trilobatin粗提物经AB-8大孔树脂富集，50%洗脱液过硅胶柱，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱液梯度洗脱，得到高纯度富含三叶苷样品的甜茶提取物(STL-E)，作为后续药理实验的样品备用。通过半制备HPLC对三叶苷进行分离制备，共得到2种主要的单体化合物，化合物Ⅰ鉴定为根皮苷，共21mg，；化合物Ⅱ鉴定为三叶苷，共320mg，纯度均≥98%。
2、STL-E对APAP致小鼠肝损伤的保护作用与作用机制
通过构建APAP肝损伤小鼠模型并对小鼠血清进行生理指标的测定发现：单次注射APAP能够导致小鼠血清中ALT，AST及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平急剧升高，经过STL-E的给药显著降低了这些细胞因子和酶的水平。STL-E在50和100mg/kg剂量预给药7天能够显著抑制小鼠肝脏中GSH的过度耗竭，并降低了MDA的水平。通过组织病理学检查和TUNEL染色发现，STL-E治疗显著改善了APAP诱导的肝细胞凋亡。此外，免疫荧光染色显示，与小鼠APAP组相比，经STL-E处理的肝组织中TNF-α标记的肝细胞减少。我们通过Western印迹分析评估了PI3K/Akt信号通路的蛋白表达及其下游蛋白的表达情况发现，APAP导致肝细胞中Bcl-2表达降低而Bax、Caspase9和Caspase3表达增加，并且PI3K/Akt信号通路中的相关蛋白表达受到抑制，STL-E预处理后相关蛋白活性得到恢复。此外，结果表明STL-E通过抑制IKKα，IKKβ和IκBα的活化来抑制NF-κB的活化。总之，本研究发现：STL-E可能部分通过参与调节PI3K/Akt信号通路及其介导的NF-κB信号通路，缓解了APAP诱导的肝损伤。
3、Trilobatin对CDDP小鼠急性肾损伤的保护作用与作用机制
基于STL-E拮抗APAP肝毒性的有益效果，本部分通过构建CDDP肾损伤小鼠模型继续探讨其主要活性成分——三叶苷Trilobatin的肾保护作用与分子机制。结果表明：与CDDP组比价，Trilobatin在50和100mg/kg剂量下给药10天能够明显降低CRE、BUN和MDA水平。同时，通过TUNEL和免疫荧光染色来观察肾脏组织的病理变化，结果表明：Trilobatin给药组可以有效改善CDDP导致的肾组织细胞的坏死和凋亡等情况的发生。重要的是，我们通过对MAPK通路相关蛋白进行Westernblot分析，其结果表明，CDDP给药后p-JNK、p-ErK、p-38等蛋白表达明显增加，而Trilonatin给药能逆转这一现象也证实上述研究结果。综上，本研究发现：Trilobatin可以有效改善CDDP给药后MAPK信号通路相关蛋白p-JNK、p-ErK、p-38等蛋白表达，从而拮抗肾细胞凋亡。
综上所述，本论文通过研究多穗柯中Trilobatin的分离纯化得到富含Trilobatin的STL-E和单体化合物，为后续药理实验提供了物质保证。此外我们通过研究STL-E对APAP肝损伤小鼠保护作用及Trilobatin对CDDP诱导的肾损伤的相关分子机制发现，其机制可能涉及缓解氧化应激、减少炎症反应及抑制细胞凋亡等方面，为Trilobatin及多穗柯的后续药理活性的研究奠定基础。