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自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是雌雄可育同株植物自花授粉后不能产生种子。大多数十字花科植物表现出自交不亲和性,柱头识别和区分“自身”的花粉,从而防止自花授粉和近亲繁殖。目前,ARC1(Arm repeat containing 1)被认为是柱头乳突细胞内SI信号传递因子。ARC1具有E3泛素连接酶的活性,通过泛素/26S蛋白酶体途径将其下游底物降解,从而导致SI反应。为了进一步解析ARC1介导的SI反应机制,我们利用羽衣甘蓝CytoTrap酵母双杂交文库,筛选到ARC1相互作用蛋白天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease 1,ASP1)部分序列。在本文中,利用RACE方法获得ASP1全长cDNA;利用原核表达纯化技术获得ASP1重组蛋白,并进行了酶活性分析;利用免疫印迹检测ASP1在组织及柱头发育中的表达情况;最后,通过酵母双杂交分析ASP1与ARC1相互作用结构域。获得主要结果如下:1、利用RACE方法获得ASP1全长cDNA。BoASP1全长cDNA序列为1596 bp,包含69 bp的5’非编码区、144 bp的3’非编码区和一个长度为1383 bp的开放读码框(ORF),对应编码一个含有460个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoASP1与油菜BnASP1、芜菁BrASP1的一致性分别为97%和93%。2、将BoASP1编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,获得pET-14b-BoASP1表达质粒。将表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,利用IPTG进行诱导表达;SDS-PAGE结果显示在分子量51 kD处有蛋白特异性地诱导表达。利用NiP+-NTA树脂通过亲和层析的方法获得BoASP1蛋白。利用这个蛋白免疫小鼠,制备BoASP1多克隆抗体。3、分别提取了羽衣甘蓝萼片、花瓣、雄蕊、柱头、花柱、子房的总蛋白,利用免疫印迹技术检测BoASP1在组织中的的表达情况。结果发现BoASP1在组织中均有表达,而且在柱头、花柱萼片中表达较高。为了进一步分析BoASP1在柱头的表达水平,分别提取了柱头不同发育时期S1-S5的总蛋白。免疫印迹技术结果显示BoASP1在柱头发育各时期没有明显变化。4、为了分析ASP1酶活性,将BoASP1构建到原核表达载体pCold上,获得pCold-BoASP1质粒,并纯化可溶性蛋白BoASP1。利用FITC标记的酪蛋白作为底物进行BoASP1蛋白相对酶活性测定。酶活性分析显示BoASP1在0-300ng范围内蛋白水解活性逐渐增强,到300ng蛋白水解活性达到最高,300-500ng蛋白水解活性逐渐下降。5、为了分析两个活性位点DTG和DSG对ASP1蛋白水解酶活性的影响,将活性位点中的天冬氨酸突变为天冬酰胺,构建突变体pCold-BoASP1-M2质粒,并纯化可溶性蛋白BoASP1-M2。酶活性分析ASP1-M2在0-500ng范围内没有蛋白水解活性。这说明BoASP1蛋白水解酶活性依赖DTG和DSG活性位点。此外,利用天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂A,能够抑制BoASP1的酶活性。这些结果说明BoASP1在体外具有天冬氨酸蛋白酶活性。6、为了分析BoASP 1与Bo ARC 1的相互作用结构域,构建pMyr-BoASP 1-4 0、pMyr-BoASP1 66-460、pMyr-BoASP1 190-460、pMyr-BoASP1280-460、pMyr-BoASP1 390-460 和pMyr-BoASP11-460-M2酵母表达载体。CytoTrap细胞质酵母双杂交系统结果显示BoASP1390-460 与 BoARC1 存在相互作用;而 BoASP16-460、BoASP1 190-460、BoASP1280-460、BoASP1-460、BoASP1-M2与BoARC1不具有相互作用。这些结果说明BoASP1390-460是与BoARC1相互作用的关键结构域。7、为了分析ARC 1与BoASP 1390-460相互作用结构域,构建pSos-BoARC1 1-271、pSos-BoARC1 1-361、pSos-BoARC1280-361、pSos-BoARC1 280-663、pSos-BoARC1362-66,pSos-BnARC1 1-280、pSos-BnARC1 1-359、pSos-BnARC1281-359、pSos-BnARC1281-661、pSos-BnARC1360-661和pSos-BnARC11-661载体。CytoTrap细胞质酵母双杂交结果显示BoARC1280-663 和 pSos-BnARC1281-661,即 U-box 结构域和 ARM 结构域与 BoASP1390-460存在相互作用;而 BoARC11-279、BoARC1-361、BoARC1280-361、BoARC1362-663与BoASP1390-460不存在相互作用。这些结果表明ARC1的C端介导了与ASP1的相互作用。