[目的]　　 乳腺生物反应器具有巨大的市场前景，目前制约其产业化发展的主要原因之一就是对乳腺特异基因表达调控机制认识不足和缺乏可在乳腺中高效、特异表达的载体。本研究以β-酪蛋白3’-端调控区序列替换掉荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列而构建出新的重组载体pGL3-F；采用重叠PCR技术将SV40增强子序列分别插入研究小组之前构建的7种重组β-酪蛋白启动子(rp-1、rp-2、rp-3、rp-4、rp-5、rp-6S和op-0)中，从而构建出7种新的重组β-酪蛋白启动子，并对它们在2种不同重组载体中引导荧光素酶报告基因表达的活性进行检测和对照分析，目的是要系统地观察：　　 (1)β-酪蛋白3’-端调控序列对重组载体中重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达活性的影响，探讨用β-酪蛋白3’-端调控序列替换载体中的SV40late poly(A)序列后，与重组β-酪蛋白启动子配对构建奶牛乳腺定位表达载体的可能性：　　 (2)在重组β-酪蛋白启动子中插入SV40增强子序列对β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达活性的影响，探讨通过在重组β-酪蛋白启动子插入外来增强子序列以提高β-酪蛋白启动子引导基因表达活性的途径；　　 (3)通过对重组载体中的重组β-酪蛋白启动子的活性进行检测和对照分析，筛选出活性最强的重组β-酪蛋白启动子，用以进一步构建奶牛乳腺高效定位表达载体，为开展奶牛乳腺生物反应器的研究奠定基础：　　 (4)通过在细胞培养液中加入催乳素或皮质激素的方法，观察催乳素和皮质激素对重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达活性的影响。　　 [方法]　　 PCR扩增获取奶牛β-酪蛋白3’-端调控序列，并将其替换掉荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列，获得重组载体pGL3-F。　　 设计1对PCR引物，扩增出研究组之前经初步改造得到的7种重组β-酪蛋白启动子rp-1、rp-2、rp-3、rp-4、rp-5、rp-6和op-0。分别克隆至含β-酪蛋白3’-端调控序列的重组载体pGL3-F上，获得7种含不同重组β-酪蛋白启动子的重组载。　　 设计3对重叠PCR引物，分别扩增出7对β-酪蛋白启动子2 kb5’-端片段、1 kb3’-端片段和SV40增强子序列，以重叠PCR技术分别将上述7对片段拼接到SV40增强子序列的两端，构建出7种中间含SV40增强子序列的重组β-酪蛋白启动子rp-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S。　　 将这7种重组β-酪蛋白启动子(4p-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S)分别克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上，获得7种含不同重组β-酪蛋白启动子的重组载体。　　 另将这7种重组β-酪蛋白启动子(rp-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S)分别克隆至含β-酪蛋白3’-端调控区序列的重组荧光素酶报告基因载体pGL3-F上，获得7种含不同重组β-酪蛋白启动子的重组载体。　　 采用脂质体技术分别将这些重组载体转染至乳腺癌细胞MCF-7，通过双荧光素酶检测系统检测这些重组表达载体中的不同重组β-酪蛋白启动子在乳腺癌细胞MCF-7中引导荧光素酶报告基因表达的效能，并通过在细胞培养液中加入催乳素或皮质醇激素的方法，观察催乳素和皮质醇激素对重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达活性的影响。　　 [结果]　　 PCR扩增、酶切产物电泳和测序鉴定结果表明：　　 (1)通过PCR扩增获取奶牛β-酪蛋白基因3’-端调控序列，并成功用它替换掉了荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列，获得重组载体pGL3-F。　　 (2)采用PCR技术成功克隆出研究组之前经初步改造得到的7种重组β-酪蛋白启动子，并成功将它们分别克隆至pGL3-F载体中，获得7种含荧光素酶报告基因、β-酪蛋白3’-端调控区和不同结构的重组β-酪蛋白启动子的重组载体。　　 (3)采用重叠PCR拼接技术成功构建出了内含SV40增强子序，且分别剔除掉5’-端调控区内所含的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转座子序列等片段，从而得到具有不同序列结构的7种重组β-酪蛋白启动子rp-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S。　　 (4)成功将7种内含SV40增强子序列的重组β-酪蛋白启动子分别克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中，获得7种含荧光素酶报告基因和不同结构的重组β-酪蛋白启动子的重组载体。　　 (5)成功将内含SV40增强子序列的重组β-酪蛋白启动子分别克隆至含有β-酪蛋白3’-端调控区序列的pGL3-F载体中，获得7种含荧光素酶报告基因、β-酪蛋白3’-端调控区和不同结构的重组β-酪蛋白启动子的重组载体。　　 (6)双荧光素酶报告系统分析测定结果显示，与天然的奶牛β-酪蛋白启动子op-0相比，重组载体rp-1S-pGL3-Basic中的重组β-酪蛋白启动子rp-1S的活性最高，其引导荧光素酶报告基因表达的活性是原始β-酪蛋白启动子op-0活性的7577％。　　 (7)对启动子rp-1S的激素调控分析结果表明，催乳素增强其引导荧光素酶表达的活性，而皮质醇激素对其活性无显著影响。　　 [结论]　　 (1)用β-酪蛋白3’-端调控区序列替换掉pGL3-Basic载体中的SV40 latepoly(A)序列后，对重组载体中的重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达的活性有一定的影响，但不足以影响用β-酪蛋白3’-端调控区序列与重组β-酪蛋白启动子配对构建奶牛乳腺定位表达载体的可行性；　　 (2)在重组β-酪蛋白启动子中插入SV40增强子序列可显著提高本研究小组之前经初步结构改造得到的7种重组β-酪蛋白启动子引导荧光素酶报告基因表达的活性；　　 (3)成功构建了7种不同结构的重组奶牛β-酪蛋白启动子和3×7种重组载体，其中重组载体rp-1S-pGL3-Basic中的重组β-酪蛋白启动子rp-1S的活性最高，其引导荧光素酶表达的活性是原始β-酪蛋白启动子op-0活性的7577％；　　 (4)催乳素能增强重组β-酪蛋白启动子rp-1S引导荧光素酶表达的活性，皮质醇激素对其活性无显著影响。