盐胁迫下旱柳cDNA文库的构建及耐盐基因的筛选

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土壤盐碱化导致的盐胁迫是抑制植物生长、降低农作物产量、减少林木生长量的主要环境因素,严重影响现代农业和林业的发展。研究植物耐盐分子机理和培育耐盐新品种,对开发和利用盐碱地具有重要意义。旱柳(Salix matsudana Koidz)抗旱、耐盐能力强,是进行耐盐机理研究和挖掘耐盐基因的良好材料。但目前国内外对旱柳在耐盐机制和耐盐基因开发利用上研究有限,所以有必要深入研究,利用旱柳这一宝贵资源开发耐盐抗旱的优良基因,为林木及作物的抗逆育种提供新的途径。 本文构建了100mmol/L NaCl胁迫处理的旱柳cDNA文库,利用不同梯度浓度的NaCl胁迫处理酵母转化子以筛选文库。筛选到的阳性克隆提取质粒DNA,进行PCR鉴定、测序,初步筛选到了两个耐盐相关的新基因,通过生物信息学技术分析基因序列,预测了蛋白质结构和功能;通过实时荧光定量PCR对其表达模式做出了分析。主要结果如下: 1)构建了盐胁迫下旱柳全长cDNA文库。通过质粒检测和PCR鉴定,外源基因已成功转入酵母受体细胞,插入cDNA片段均在500-2000bp之间,平均长度在1000bp左右,说明文库质量较高。旱柳全长cDNA文库的构建,为对其进行功能基因组研究创造了前提和基础。 2)通过逐步提高盐浓度来筛选盐胁迫下旱柳全长cDNA文库,得到两个耐受130g/L的酵母转化子,提取阳性克隆的质粒并通过PCR扩增检测,两个插入片段分别为615bp和1152bp,并对其测序,序列比对结果表明1152bp的cDNA 是耐盐相关基因。 3)生物信息学分析表明,该基因序列于32-328位存在一个长297bp的开放阅读框,编码98个氨基酸。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因是盐胁迫下表达的,盐胁迫两小时后,该基因的表达水平开始发生变化,表达量开始上调,随着胁迫时间的增长,表达量相对增加,在12-24h达到表达高峰。
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