目的:本研究以灰树花提取物作为一种天然免疫调节剂,以脾虚小鼠模型作为观察对象,探讨灰树花提取物对脾虚小鼠的细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制,从现代免疫学角度揭示脾虚证发生、发展的本质,为临床的脾虚证提供一种天然有效的免疫调节剂。材料与方法:将健康清洁级昆明小鼠随机分为6组,即空白对照组、脾虚组、脾虚+阳性药物组(2mg/Kg,香菇多糖)、脾虚+灰树花提取物低剂量组(5mg/Kg)、脾虚+灰树花提取物中剂量组(10mg/Kg)、脾虚+灰树花提取物高剂量组(20mg/Kg)。采用番泻叶-劳倦过度复合因素造模法制做脾虚小鼠模型,之后腹腔注射灰树花提取物10天,第11天处死动物,完整摘取小鼠脾脏及胸腺,测定其重量,计算脾指数和胸腺指数。常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞,检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红、产生一氧化氮(NO)能力(Griess法),MTT法检测T、B淋巴细胞转化率、自然杀伤细胞(NK细胞)杀伤活性。酶联免疫吸附法(ELISA法)检测小鼠血清IFN-γ和IL-4的含量,流式细胞仪检测各组小鼠外周血CD3~+T、CD4~+T、CD8+T含量。免疫组化法观察脾脏凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Fas、FasL的表达,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定脾脏凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA的表达。结果:1.灰树花提取物对脾虚小鼠体重和胸腺指数、脾指数的影响造模14天后脾虚组小鼠体重明显低于空白组(P<0.01),脾虚组小鼠胸腺指数和脾指数较空白组降低,但差异无统计学意义(P>0.05),其中脾指数下降较为明显。给予灰树花提取物10天后,灰树花提取物低、中、高剂量组小鼠体重明显高于脾虚组(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01)。同时低、中、高剂量组灰树花提取物的脾指数明显高于脾虚组(分别为P<0.05,P<0.05,P<0.01)。2.灰树花提取物对脾虚小鼠腹腔巨噬细胞的影响脾虚组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和产生NO能力均降低,高剂量灰树花提取物可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力(P<0.05)和产生NO能力(P<0.01)。3.灰树花提取物对脾虚小鼠脾淋巴细胞的影响脾虚组小鼠脾脏B淋巴细胞增殖能力比空白组明显下降(P<0.01),高剂量灰树花提取物能明显提高小鼠脾脏B淋巴细胞增殖能力(P<0.01)。脾虚组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力比空白组降低,中、高剂量的灰树花提取物能明显提高小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力(P<0.05和P<0.01);并且高剂量灰树花提取物对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力也强于空白组(P<0.05)。脾虚组小鼠脾脏NK细胞杀伤能力比空白组明显降低(P<0.01),灰树花提取物中、高剂量组小鼠脾脏NK细胞杀伤能力均明显高于脾虚组(P<0.01)。4.灰树花提取物对脾虚小鼠外周血T亚群的影响脾虚组CD4~+ T淋巴细胞百分率与空白组相比未见显著性差异,脾虚组CD8+ T淋巴细胞百分率比空白组明显升高(P<0.05),灰树花提取物高剂量组小鼠外周血CD4 +T淋巴细胞百分率增高有显著性差异(P<0.05);各组CD8+ T淋巴细胞百分率未见显著性差异(P>0.05)。脾虚组CD4 /CD8比值比空白组明显降低(P<0.01),中、高剂量组灰树花提取物可以明显提高脾虚小鼠的CD4 /CD8比值(P<0.01)。脾虚组的CD3~+T淋巴细胞百分率比空白组明显降低(P<0.01),中、高剂量组灰树花提取物可以明显提高脾虚小鼠的CD3~+T淋巴细胞百分率(P<0.01)。5.灰树花提取物对脾虚小鼠血清IFN-γ和IL-4含量的影响造模后,脾虚组小鼠血清IFN-γ含量比空白组明显降低(P<0.01),血清IL-4含量明显比空白组增高(P<0.05),中、高剂量组灰树花提取物可以明显提高脾虚小鼠血清IFN-γ含量(P<0.01),高剂量组灰树花提取物可以降低血清IL-4含量(P<0.01)。6.灰树花提取物对脾虚小鼠Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白表达的影响脾虚组Bax、Fas、FasL阳性产物平均灰度值(平均灰度值与表达量成反比)明显低于空白组(P<0.01),给予阳性对照组药物和低、中、高剂量的灰树花提取物后,Bax、Fas、FasL阳性产物平均灰度值比脾虚组明显升高(P<0.01)。脾虚组Bcl-2阳性产物平均灰度值明显高于空白组(P<0.01),给予阳性对照组药物和低、中、高剂量的灰树花提取物后,Bcl-2阳性产物平均灰度值比脾虚组明显降低(P<0.01)。7.灰树花提取物对脾虚小鼠Bcl-2、Bax、Fas、FasLmRNA表达的影响与空白组比较,脾虚组小鼠脾脏Bax、Fas、FasL mRNA表达显著升高(P﹤0.05,P﹤0.01和P﹤0.01),Bcl-2 mRNA表达显著降低(P﹤0.01);与脾虚组相比较,脾虚小鼠给予阳性对照药物和低、中、高剂量灰树花提取物后, Bax、Fas、FasL mRNA表达显著降低(P﹤0.01),Bcl-2 mRNA表达显著升高(P﹤0.01)。结论:1.通过番泻叶-劳倦过度复合因素造模法制做脾虚小鼠模型,造模后脾虚小鼠体重明显下降,脾指数下降,灰树花提取物能够增加脾虚小鼠的体重、有效改善脾虚所致的脾指数下降。2.灰树花提取物可以通过增强脾虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力;可以通过NO途径,增加NO的产生量来发挥巨噬细胞的生物学功能;灰树花提取物可以通过增强脾脏B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖能力来提高脾虚小鼠的免疫功能;灰树花提取物还可以通过提高NK细胞的杀伤活性来提高脾虚小鼠的免疫功能。3.灰树花提取物可以改善脾虚时造成的小鼠CD4 /CD8比值降低,可能主要是通过作用于Th细胞来提高细胞免疫功能。灰树花提取物可以有效地升高脾虚小鼠血清中IFN-γ含量,下调IL-4的含量,从而平衡Th1/Th2亚群,使Th2细胞反应向Th1细胞转化,改善脾虚病理改变。4.灰树花提取物可能通过促进Bc1-2蛋白与基因的表达、抑制Bax、Fas、FasL蛋白与基因的表达、提高Bcl-2/Bax的比值,通过影响线粒体、死亡受体依赖的凋亡途径来抑制脾淋巴细胞凋亡的发生。