克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇工艺研究

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1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简称1,3-PD)是一种重要的化工原料,被广泛应用于印染、涂料、油墨、药物、抗冻剂、润滑剂等领域,尤其作为单体合成新型聚酯材料PTT(聚对苯二甲酸丙二醇酯)受到人们广泛关注。1,3-PD的生产方法主要有化学合成和微生物发酵法,由于石化资源的短缺,近年来微生物发酵法生产1,3-PD成为国内外研究的热点。本文从工业化角度出发,研究了5L发酵罐中1,3-PD分批和补料分批发酵工艺,并在摇瓶中研究了Klebsiella pneumoniae固定化发酵1,3-PD的可行性,最后研究了发酵液中1,3-PD的分离纯化工艺,为1,3-PD工业化生产提供了指导数据。首先,在5L发酵罐中研究了Klebsiella pneumonia2-1的分批发酵条件,通过单因素分析和正交实验,确定了最佳工艺条件:初始甘油浓度50g/L,(NH4)2SO4浓度6g/L,最适温度37℃,最适pH7.0,最佳接种量为10%,在此条件下菌体的生长速率和1,3-PD的生成速率都较快,其中1,3-PD最大浓度为24.79g/L,发酵强度为2.479g/(L·h),转化率达到54%(g/g)。其次,在分批发酵优化条件的基础上,对Klebsiella pneumonia2-1补料分批发酵工艺进行了研究,通过对不同补料起始时间和不同补料方式(连续恒速流加、间歇定量流加、甘油反馈流加)对发酵结果影响的比较,确定了该菌补料分批发酵的最优条件:在对数生长中期,按照甘油反馈流加方式,使底物甘油浓度保持在20g/L左右。研究表明,按照甘油反馈流加方式发酵到第24h时,菌体650nm吸光值为10.38,1,3-PD的浓度为80.45g/L,生产强度为3.35g/(L·h),其中甘油对1,3-PD的质量转化率达到了62.8%,明显优于其他补料方式的发酵结果。第三,研究了固定化Klebsiella pneumonia2-1发酵生产1,3-PD的可行性。通过对四种常见的包埋材料固定化Klebsiella pneumonia2-1发酵生产1,3-丙二醇的研究发现,海藻酸钙固定化无论在制备难易还是在发酵强度上都有很大优势,并进一步确定了海藻酸钙固定化的最优条件:海藻酸钠浓度6%(w/v),CaCl2浓度4%(w/v),交联时间4h。相对于游离发酵,固定化发酵1,3-丙二醇终浓度提高了7.4%,发酵强度达到了1.04g/(L h)。此外,固定化颗粒连续发酵6批次,机械强度和发酵水平并没有明显降低。最后,初步探索了Klebsiella pneumonia2-1发酵液中1,3-PD的分离纯化工艺,对1,3-PD发酵液中菌体、蛋白和盐类的去除工艺进行了研究。实验表明,壳聚糖是一种很好的有机大分子絮凝剂,其最佳的絮凝条件为:壳聚糖终浓度为0.6g/L,温度为37℃,pH为5.0,搅拌时间20min,静置20min,此时1,3-PD发酵液中菌体的去除率达到了99.87%。此外,利用添加氯化钙并煮沸的方法可以去除发酵液中84.7%的蛋白质;采用醇沉-超滤除盐工艺,盐的去除率达到了79.2%,并且得到了纯度为85.68%的1,3-PD粗提液。
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