研究背景 缺血性心肌病目前是引起人类死亡和致残的主要疾病之一。由于冠状动脉的狭窄和闭塞产生组织供血和供氧缺乏,伴随产生心绞痛、心肌梗塞、心律失常及充血性心力衰竭等症状,而心功能恶化到Ⅳ级的缺血性心肌病患者,1年死亡率可达到60%。在过去几十年里,药物治疗、经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)、冠状动脉搭桥术(CABG)及心脏移植等已经显著改善了缺血性心肌病患者的预后。尽管这些治疗措施已经取得了很大的进步,但仍存在许多限制,例如,冠状动脉旁路移植术虽可重建心肌梗塞区血供,改善冬眠心肌功能,但对于已形成的瘢痕组织则无能为力,心脏移植存在供体心脏短缺,移植后需要长期进行免疫抑制治疗,另外移植后有冠状动脉硬化等并发症。 在这种情况下,有人提出可以通过再生心肌细胞,即心肌细胞成形术,来治疗缺血性心肌病导致的心肌梗塞甚至心力衰竭,也就是通过移植外源性细胞到损伤的心肌中,用足量的具有收缩功能的细胞恢复和改善病变区域心肌的功能。 目前在动物实验中有多种细胞被用来进行心肌细胞成形术,胚胎心肌细胞、胚胎干细胞、成肌细胞(即骨骼肌卫星细胞)及骨髓间质干细胞等被陆续移植入动物心脏。骨髓间质干细胞可以反复从骨髓中获得,并可在离体环境中扩增,具有多向分化潜能,自体移植后没有免疫排斥反应以及伦理等相关问题,目前是研究得较多的进行细胞移植以治疗缺血性心肌病的供体细胞。 本课题在离体和在体实验中,初步研究了骨髓间质干细胞的生物学特性、体外诱导分化能力,以及作为进行细胞移植的供体细胞来治疗缺血性心肌病的可行浙江大学博士研究生学位论文性。实验方法1、应用60%的PercoU细胞分离液分离骨髓间质干细胞,接着进行培养和传代。应 用MTT方法测定培养细胞的生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期和鉴定 培养细胞的纯度。2、应用RT-PCR、W七stem Blot、免疫荧光染色和透射电镜验证经过5一杂氮胞营诱 导后的骨髓间质干细胞向肌细胞分化的状况。3、用结扎冠状动脉的方法制造动物心肌梗塞模型,用Brdu(bromodeox”ridine,5- 澳脱氧尿核昔)标记自体骨髓间质干细胞后,注射到缺血1周的心肌组织中,4 周后用激光共聚焦显微镜验证移植的骨髓间质干细胞向肌细胞分化的状况,同 时应用多导生理记录和分析处理系统及心脏彩超测定移植骨髓间质干细胞后 实验动物的心功能。实验结果1、骨髓间质干细胞具有贴壁生长特性,多数为成纤维样的梭形细胞,原代细胞 12一16d左右铺满培养瓶,传代细胞的生长较原代要快,经过9一14d左右铺满, 传代培养的细胞12h贴壁率达到90%。培养的骨髓间质干细胞处于G了Gl期的 细胞为82.49%,处于s十GZ+M期的细胞为17.51%,大部分细胞处于相对不活 跃的静止期,只有小部分处于活跃增殖状态。应用Percon细胞分离液分离和培 养的骨髓间质干细胞均一性较好,细胞表面抗原CD29,CD44表达为阳性, CD34,CD45表达为阴性。2、经过5一杂氮胞营诱导的骨髓间质干细胞形态被逐渐改变,细胞的体积逐渐的增 加,并且在一个方向伸长,可见细胞融合形成肌管结构。通过透射电镜可以观 察到诱导后的骨髓间质干细胞有肌丝形成,表达出心肌特异性的转录因子 NkxZ一5/Csx(同源异型盒基因)和G川叭4(锌指转录因子),同时表达出在胚 胎期占优势的心肌细胞特异性的p一MHC(p一肌球蛋白重链),没有表达出在 成年期占优势的心肌细胞特异性的Q一MHC(Q一肌球蛋白重链)。另外,经过 诱导的骨髓间质干细胞表达出肌小节肌动蛋白。一 Sareomeri。Actin和横纹肌中 间丝蛋白Desmin,说明诱导后的骨髓间质干细胞向肌细胞分化。3、移植自体骨髓间质干细胞后,心功能较未移植的动物明显增高,被BrdU标记