目的:1.B细胞在自身免疫性疾病中发挥着重要作用,通过检测两类常见的自身免疫性疾病:系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血中B细胞亚群,并与健康人外周血中B细胞亚群进行比较,寻找与自身免疫性疾病相关的B细胞新亚群;2.随后检测了SLE和RA患者外周血中滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh),和外周辅助性T淋巴细胞(Tph)的频率,分析了这两群辅助性T细胞与自身免疫性疾病相关B亚群的相关性。3.最后评价了SLE患者在进行B细胞活化因子BAFF(B-cell-activating factor)单抗治疗中,自身免疫性疾病相关B细胞亚群对治疗的敏感性。4.通过以上研究希望能找到自身免疫性疾病相关的新B细胞亚群,通过分析T,B细胞相互作用,寻找新B细胞亚群在疾病发展中的作用,为SLE的临床治疗及预后评估提供新的科学思路和理论支持。方法:1.临床采取陆军军医大学第一附属医院风湿免疫科的ds-DNA阳性、经过正规疗程激素及免疫抑制剂治疗后,临床治疗仍未达标的SLE患者44例作为SLE实验组;23例类风湿关节炎患者外周血与关节积液配对患者作为RA实验组;选取30例正常人作为健康对照组。2.利用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离健康对照组、RA患者以及SLE组患者外周血淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和RA患者的关节积液,流式细胞术检测其B细胞亚群具体如下:类型转换记忆B细胞(Switch memory B cell,SM,CD19+CD70-CD27+Ig D-)、双阴性记忆B细胞(Double negative B cell,DN,CD19+CD70-CD27-Ig D-)、静息B细胞(Resting B cell,RB CD19+CD70-CD27-Ig D+)、未类型转换B细胞(No-switch memory B cell,NSM,CD19+CD70-CD27+Ig D+)以及浆母细胞(Plasmablast,PB(CD19+CD70-CD27+Ig D-CD38+)、浆细胞(Plasma cell CD19-CD27+CD38+)。3.进一步我们分析了SLE患者外周血和RA患者外周血及关节积液中B细胞亚群的比例跟临床的相关性;4.随后我们采用流式细胞检测术分析分析了B细胞活化相关的关键细胞亚群Tfh(CXCR5+PD-1+)和Tph(CXCR5high PD-1+),同时分析了Tfh细胞和Tph细胞与各B细胞亚群的相关性。5.最后,采取3例重症患者BAFF单抗治疗前后外周血,检测类型转换记忆B细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D-)、双阴性记忆B细胞(CD19+CD70-CD27-Ig D-)、静息B细胞(CD19+CD70-CD27-Ig D+)、未类型转换B细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D+)以及浆母细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D-CD38+)、浆细胞(CD19-CD27+CD38+)6个细胞亚群比例变化,观察BAFF单抗治疗比较敏感的B细胞亚群。结果:1.难治性SLE患者外周血中各B细胞亚群比例与健康对照组相比,浆细胞(CD19-CD27+CD38+)比例显著升高(P<0.05);浆母细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D-CD38+)比例显著增加(P<0.01);未类型转换的记忆B细胞(CD27+Ig D+)比例显著降低(P<0.01)。而其中双阴性B细胞(CD27-Ig D-)升高的比例尤其显著(P<0.0001);2.难治性SLE患者CD19+B淋巴细胞比例较健康对照组有上升的趋势,类型转换记忆B细胞也有上升趋势,而静息B细胞百分比有下降的趋势,但均无统计学意义;3.SLE患者外周血B细胞亚群与临床指标进行相关性分析:结果发现:24小时尿蛋白与双阴性B细胞呈正相关,其他B细胞亚群与各临床指标无明显相关性。4.RA患者外周血中各B细胞亚群比例与健康对照组相比:CD19+B细胞比例显著增加(P<0.0001),未类型转换记忆B细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D+)比例显著下降(P<0.0001),双阴性B细胞(CD27-Ig D-)比例显著增高(P<0.001)。5.RA患者关节腔积液B细胞亚群比例与同一患者外周血相比:静息B细胞(CD27-Ig D+)比例显著下降(P<0.0001),浆母细胞(CD19+CD70-CD27+Ig D-CD38+)比例稍有增高(P<0.05),类型转换记忆B细胞(CD27+Ig D-)比例明显升高(P<0.001),其中双阴性B细胞(CD27-Ig D-)比例显著增高(P<0.001)。6.SLE患者外周血Tph、Tfh细胞与健康对照组相比:SLE患者外周血中Tph细胞(CD4+PD-1hiCXCR5-)比例明显升高(P<0.05),Tfh细胞(CD4+PD-1hi CXCR5+)比例明显升高(P<0.05)。7.SLE患者外周血中Tph细胞与SLE患者外周血中浆细胞和DN细胞相关性:SLE患者外周血中Tph细胞与SLE患者外周血中浆细胞呈正相关,与DN细胞呈负相关。8.BAFF单抗治疗前后,SLE病人外周血B细胞亚群的变化情况:治疗前后相比,CD19+B细胞显著下降,双阴性B细胞显著增高,而24小时尿蛋白显著减少。结论:1.自身免疫性疾病中存在一群CD27-Ig D-双阴性的记忆性B细胞,其比例明显高于健康对照组,提示DN B细胞是疾病诊断的敏感指标,可作为疾病的早期诊断标志之一;2.SLE患者体内DN B细胞显著增高,与SLE患者24 h蛋白尿的量呈正相关性,提示DN B细胞亚群的比例可能反映肾小球病变程度及肾脏累及程度;3.SLE患者体内Tph的比例明显增加,而Tfh的比例无明显区别,提示在SLE中发挥B细胞功能辅助作用的主要是Tph细胞,而不是Tfh细胞;4.SLE患者体内Tph与浆细胞的产生有一定的正相关,但是无统计学意义,而Tph与DN B细胞的表达呈负相关;结合SLE病人的分层分析,随着疾病加重,浆细胞增加,而DN B细胞数目减少,提示可能存在DN B细胞在Tph的辅助下转化为浆细胞的过程,从而导致Tph促进DN B转化造成的浆细胞增加,而DN B细胞反而减少的现象;5.BAFF单抗可能抑制了DN B转化为浆细胞的能力,从而导致治疗后DN B细胞比例增加,而浆细胞比例在治疗后显著下降。DN B和Tph的相互作用机制值得进一步深入研究。