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磁性纳米颗粒具有比表面积大、可均匀分散于反应体系、表面易修饰为各种不同活性基团等优点，以其为载体固定化的酶在反应体系中几乎不存在传质阻力，且能够非常容易地在外加磁场作用下分离回收以重复使用，从而大大降低酶的使用成本。其中磁性纳米颗粒共价交联固定化酶稳定性最佳。但传统的共价固定化载体多随机与酶分子上的活性基团共价交联，这可能导致底物进入酶活性位点的通道被阻塞，或形成多位点结合，更甚者，当共价结合位点在酶催化活性中心附近时，会造成酶活性构象发生不可逆的改变，导致酶活大幅降低。为此，本文通过生物信息学分析获知酶的结构信息，以此为基础，开发简便易行的定向固定化方法。针对不同酶种采用不同固定化体系，并首次使用反胶束固定化体系，获得了高催化性能的固定化酶。同时也为其它酶种的定向固定化提供有益借鉴。本文以自制Fe3O4磁性纳米颗粒（MNPs）为载体，定向固定化解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶LIP2(YLLIP2)和洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）脂肪酶（BCL），并进行了应用探索，主要研究内容及结果摘要如下：1.通过化学共沉淀法了制备了MNPs，并以（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）包覆其表面，得到带-NH2功能化的A-MNPs。采用XRD和FT-IR对其进行表征，XRD图谱证实所得磁性纳米颗粒为Fe3O4MNPs，且Fe3O4晶相呈现出反尖晶石型，不含其它杂相，说明制备的磁性纳米晶纯度极高。FT-IR检测结果表明，APTES成功实现了对MNPs的包覆。所制备的磁性纳米颗粒MNPs、A-MNPs粒径分别为17.2nm和18.4nm。2.通过分析YLLIP2和BCL一级结构，获知了两种酶蛋白的氨基酸组成及带不同活性基团的氨基酸残基含量。运用Rasmol软件进一步分析了两种酶的三维构象，研究酶蛋白中的游离-NH2、-COOH、-OH、-SH在其分子上的分布。结果显示，两种酶的游离-NH2在酶分子上呈现区域化分布，距离酶的催化活性中心均较远，而其它活性基团则相对均一地分布在酶分子上。为此，选择游离氨基作为共价固定结合点，以定向固定化YLLIP2和BCL。在此基础上，结合固定化载体性质，拟定了分别通过酶蛋白上的游离-NH2和-COOH为共价结合点的两种不同固定化策略，实现酶的固定化。结果表明：YLLIP2通过酶上游离氨基和羧基固定化，固定化酶蛋白比活力分别为游离酶的36.9%、17.3%；而BCL通过酶上游离氨基和羧基固定化，固定化酶蛋白比活力分别为游离酶的128.2%和94.6%。验证了生物信息学分析的结论。3.确定以游离氨基为共价固定结合点后，以醛基活化的A-MNPs （G-MNPs）为载体，在水相中共价固定化YLLIP2和BCL，并对其固定化条件进行了单因素优化。结果表明，两种酶在水相固定化体系中，固定化率均较高，可达85%以上。在最优条件下，水相固定化YLLIP2的水解酶活回收率为42.4%；而BCL在固定化体系中存在甘油酯作为激活剂和保护剂的条件下，固定化酶活力得到大幅度提高，其酯化酶活回收率高达1081.9%。4.以G-MNPs为固定化载体，首次在反胶束固定化体系中实现了对YLLIP2和BCL的定向共价固定化。YLLIP2在Span20反胶束体系中定向固定化后，水解酶活回收率可达540.2%。优化条件为表面活性剂Span20，W0=1.12，正己醇为助表面活性剂且Z=2.26时，酶活回收率进一步提高到1466.1%。同样，BCL在AOT反胶束固定化体系，W0=10，正丁醇为助表面活性剂且Z=2时，其酯化酶活回收率可达989.5%。5.研究了固定化YLLIP2和BCL的酶学性质。固定化YLLIP2的最适温度为30℃，较游离酶提高5℃，最适pH为8.0，与游离酶保持一致；其温度稳定性有了大幅提高，40℃下孵育1小时，固定化YLLIP2的残余酶活保留61.8%，而游离YLLIP2仅为34.3%；pH稳定性也得到大幅增强，pH7.5下孵育1小时，固定化YLLIP2残余活力为81.5%，而游离YLLIP2仅有36.4%。固定化BCL的最适温度为45℃，比游离BCL提高5℃，最适pH为7.0，与游离酶一致；其温度稳定性提高显著，65℃下孵育1小时，固定化BCL的残余活力高达82.4%，而游离BCL的仅为28.9%；其pH稳定性在游离酶拥有的良好耐受性的基础上又有所提高。6.以固定化YLLIP2为催化剂，催化鱼油水解以富集DHA制备功能性油脂。结果表明，反应12h，其水解度及DHA含量达到40.2%和36.8%，相对的游离酶水解度和DHA仅为27.3%和31.6%。制备的功能性油酯DHA含量较初始鱼油提高了90%。此外，还研究了YLLIP2的回用性，经过20批次的重复使用，固定化YLLIP2仍然保持80%的初始活力。以固定化BCL催化大豆油与乙醇转酯反应制备生物柴油，在30%叔丁醇反应体系（w/w），醇油摩尔比4：1，反应温度45℃下，生物柴油得率达84.9%，经10批次的重复使用，酶活几乎不降低，生物柴油得率维持在80%以上。