论文部分内容阅读
目的:探究lncRNA KB-1980E6.3在乳腺癌干细胞干性维持中的作用及其分子机制研究。方法:（1）采用RNA-seq鉴定出人乳腺癌细胞株中低氧反应性lncRNAs（HRLs）,q RT-PCR验证芯片结果,并挑选出表达差异最大的HRL;q RT-PCR检测常氧和低氧处理后,乳腺癌细胞株中lncRNA KB-1980E6.3的表达量;q RT-PCR检测低氧处理后,不同时间点乳腺癌细胞株中lncRNA KB-1980E6.3的表达量;采用核浆分提手段获得细胞核与细胞质RNA,检测低氧培养条件下lncRNA KB-1980E6.3在人乳腺癌细胞中的定位;q RT-PCR检测乳腺癌和癌旁组织,以及不同分期的乳腺癌病人肿瘤样本中lncRNA KB-1980E6.3的表达量。（2）利用shRNA在BT549和Hs578T细胞中敲低HIF-1α和HIF-2α,q RT-PCR和Western Blot验证沉默效率;q RT-PCR检测常氧和低氧处理后,敲低HIF-1α或HIF-2α的BT549和Hs578T细胞中lncRNA KB-1980E6.3的表达差异;采用双荧光素酶报告实验和染色质1免疫共沉实验（Ch IP）,验证低氧条件下HIF对lncRNA KB-1980E6.3表达的调控作用。（3）利用shRNA在BT549和Hs578T细胞中敲低lncRNA KB-1980E6.3,或利用慢病毒包装的质粒在BT549和Hs578T中过表达lncRNA KB-1980E6.3,q RT-PCR验证沉默与过表达效率;运用KEGG分析lncRNA KB-1980E6.3相关的信号通路;采用乳腺癌干细胞微球体（mammospheres）形成实验,检测敲低和过表达lncRNA KB-1980E6.3对干细胞微球体形成能力的影响;采用克隆形成实验,观察敲低和过表达lncRNA KB-1980E6.3后,细胞集落形成的情况;采用裸鼠皮下成瘤实验,检测lncRNA KB-1980E6.3对乳腺癌干细胞（BCSCs）体内成瘤的影响。（4）qRT-PCR和Western Blot检测敲低或过表达lncRNA KB-1980E6.3后,对Nanog、OCT4、KLF4、SOX2、c-Myc表达的影响;q RT-PCR检测乳腺癌和癌旁组织,以及不同分期的乳腺癌病人肿瘤样本中c-Myc的表达量;基于TCGA数据库,分析临床乳腺癌样本中,lncRNA KB-1980E6.3与c-Myc表达的关系;应用免疫组织化学（IHC）检测乳腺癌组织切片中c-Myc蛋白的表达情况;采用相关性分析评估lncRNA KB-1980E6.3与c-Myc之间的相关性;采用放线菌素D分别处理lncRNA KB-1980E6.3敲低与过表达的细胞,q RT-PCR检测不同时间点细胞中c-Myc mRNA的含量。（5）采用RPISeq网站预测lncRNA KB-1980E6.3与胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）之间的结合概率;RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测IGF2BP1与lncRNA KB-1980E6.3以及c-Myc的结合情况;RNA pull down联合Western Blot实验检测生物素标记的全长或截短的lncRNA KB-1980E6.3与IGF2BP1的结合情况;RIP实验联合q RT-PCR检测全长或截短的IGF2BP1与lncRNA KB-1980E6.3的结合情况;采用放线菌素D处理lncRNA KB-1980E6.3沉默+IGF2BP1过表达的细胞,q RT-PCR检测不同时间点细胞中c-Myc mRNA的含量;q RT-PCR和Western Blot检测lncRNA KB-1980E6.3沉默+IGF2BP1过表达的细胞中c-Myc的表达水平;q RT-PCR和Western Blot检测lncRNA KB-1980E6.3敲低后,对IGF2BP1表达的影响;采用生物素标记DNA探针的内源RNA富集实验、q RT-PCR和Western Blot验证lncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc不稳定编码区（CRD）mRNA复合体之间的关系。（6）采用mammospheres形成实验、克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验,联合验证lncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc轴对BCSCs干性维持及体内成瘤的影响。结果:（1）与常氧相比较,低氧显著促进了人乳腺癌细胞中lncRNA KB-1980E6.3的表达,且随低氧处理时间的延长,lncRNA KB-1980E6.3的表达量逐渐增加;lncRNA KB-1980E6.3主要位于人乳腺癌细胞的细胞质中;lncRNA KB-1980E6.3在乳腺癌样本中表达升高,且与肿瘤病人临床分期相关。（2）在低氧微环境中,沉默HIF-1α降低了lncRNA KB-1980E6.3的表达;沉默HIF-2α,对lncRNA KB-1980E6.3的表达无影响;在低氧微环境中,HIF-1α通过与lncRNA KB-1980E6.3启动子区域的低氧反应原件（HRE）结合,激活lncRNA KB-1980E6.3的转录。（3）与常氧组比较,低氧组中mammospheres数量增加,且体积变大;敲低lncRNA KB-1980E6.3后,mammospheres数量减少,且体积变小;过表达lncRNA KB-1980E6.3后,mammospheres数量增加,体积变大;克隆形成实验显示lncRNA KB-1980E6.3可影响乳腺癌细胞的集落形成能力;lncRNA KB-1980E6.3促进BCSCs体内成瘤。（4）敲低lncRNA KB-1980E6.3抑制肿瘤干细胞（CSCs）相关基因的表达,过表达lncRNA KB-1980E6.3则促进CSCs相关基因的表达,而lncRNA KB-1980E6.3对c-Myc基因的调控尤为显著;c-Myc在乳腺癌样本中表达升高,且与肿瘤病人临床分期相关;在临床乳腺肿瘤组织中,lncRNA KB-1980E6.3和c-Myc表达呈正相关性;敲低lncRNA KB-1980E6.3导致c-Myc mRNA的稳定性降低;过表达lncRNA KB-1980E6.3,c-Myc mRNA的稳定性升高。（5）与常氧组比较,低氧组中IGF2BP1沉淀得到的复合物中lncRNA KB-1980E6.3和c-Myc更多;与lncRNA KB-1980E6.3反义链组相比,lncRNA KB-1980E6.3正义链可与IGF2BP1相互作用;lncRNA KB-1980E6.3与IGF2BP1结合互作的核心区域位于201-400nt;IGF2BP1与lncRNA KB-1980E6.3结合互作的核心区域是KH1/2结构域;敲低lncRNA KB-1980E6.3+过表达IGF2BP1后可以观察到c-Myc mRNA稳定性、c-Myc mRNA及蛋白表达量得到回复;敲低lncRNA KB-1980E6.3不影响IGF2BP1的表达;在低氧微环境中,相较于c-Myc CRD MUT组,c-Myc CRD WT组中lncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1复合体结合的c-Myc CRD mRNA更多;沉默lncRNA KB-1980E6.3或IGF2BP1,lncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1复合体结合的c-Myc CRD mRNA显著减少;在低氧微环境中,相较于c-Myc CRD MUT组,c-Myc CRD WT组中c-Myc mRNA的稳定性较高,c-Myc mRNA和蛋白的表达水平较高;沉默lncRNA KB-1980E6.3或IGF2BP1,c-Myc mRNA的稳定性显著降低,其mRNA和蛋白的表达水平也相应降低。（6）体外联合体内实验的结果表明:lncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc信号轴促进BCSCs的干性维持和体内成瘤。结论:（1）LncRNA KB-1980E6.3是低氧反应性lncRNA且在乳腺癌中高表达。（2）HIF-1α促进了lncRNA KB-1980E6.3的表达。（3）LncRNA KB-1980E6.3促进BCSCs干性维持。（4）LncRNA KB-1980E6.3通过增加c-Myc mRNA稳定性提高c-Myc的表达。（5）LncRNA KB-1980E6.3通过与IGF2BP1结合增加c-Myc mRNA的稳定性。（6）LncRNA KB-1980E6.3/IGF2BP1/c-Myc信号轴促进BCSCs干性维持和体内成瘤。