论文部分内容阅读
高血压,是一种全球人类最常见的慢性病；也是引起脑血管病、心脏病、肾脏病的发生和死亡的最主要因素。我国居民的高血压患病率持续增长,现有高血压病患者约2亿人。所以,治疗和预防高血压病是当今社会十分重要的研究课题。血管紧张素转换酶(Angiotensin-I-converting enzyme, ACE)在血压调节系统中占据关键位置,ACE抑制剂是目前治疗高血压的有效药物。1977年,Cushman等首次合成了ACE抑制类药物卡托普利(Captopril)。合成的ACE抑制剂显著地降低了高血压,但临床呈现许多不良反应,如皮疹、咳嗽以及味觉功能紊乱等。食源性的ACE抑制肽与合成ACE抑制剂相比,温和、安全且易于吸收,同时还兼具其他功能特性。因此,越来越多的科学工作者倾向于从食物中获取ACE抑制肽。1965年,Ferreira首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现了具有ACE抑制活性的多肽；自此之后,人们从各种动植物和海洋生物原料中分离出多种具有降血压功能的活性多肽,比如来源于燕麦、玉米、紫菜、大豆、牛乳、螺旋藻、鲣鱼、海鲤等的ACE抑制肽。目前,我国年产生猪约5亿头,是世界上生猪产出最多的国家；由屠宰生猪而产生的副产物猪血大约有150万吨,猪血蛋白资源非常巨大。猪血红蛋白是一种重要的蛋白质资源,具有较高的营养价值,科学地开发利用猪血红蛋白,对于为人类提供更多的优质蛋白质资源和开发功能性食品具有重要意义。研究发现,与其它蛋白源酶解得到的ACE抑制肽相比较,猪血中的血红蛋白酶解产物具有较高的ACE抑制活性。近年来,国内外一些学者对酶解猪血红蛋白制备具有ACE抑制活性的多肽进行了相关研究。本文的研究工作主要是猪血红蛋白ACE抑制肽的制备及其纯化。首先以猪血为原料制备猪血红蛋白,选择合适的蛋白酶进行酶解工艺试验,然后依次采用大孔树脂、葡聚糖凝胶和半制备高效液相色谱分离法对猪血红蛋白ACE抑制肽进行分离纯化,最后测出具有最高降血压活性的ACE抑制肽的氨基酸序列,为猪血蛋白资源的深入开发利提供实验数据。本文主要研究结果如下：(1)猪血红蛋白水解酶的选择试验本试验选择胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和木瓜蛋白酶六种蛋白酶对猪血红蛋白进行酶解试验,以DH和ACE抑制率作为考察指标,最后得出胃蛋白酶制备的抑制肽具有较高的ACE抑制率,达到70.09%。因此,选择胃蛋白酶作为试验用酶。(2)猪血红蛋白酶解工艺参数的优化试验通过酶解温度、酶解pH、底物浓度、加酶量和酶解时间的单因素试验,得出其较佳值,在此基础上再进行Central Composite Design响应面试验,最后得出其最佳的酶解技术工艺参数为：酶解温度37.60℃,酶解pH1.98,底物浓度4.98%,加酶量3.04%,酶解时间4h,在此条件制备的酶解产物的IC50为1.53mg. mL-1,其响应面曲线方程为：Y=68.28+1.14X1-0.12X2-0.063X3+0.012X4-0.069X1X2+0.044X1X3+0.16X1X4-0.44X2X3-0.13X2X4-0.094X3X4-1.90X12-1.70X22-2.07X32-2.09x42。(3)大孔树脂分离纯化猪血红蛋白ACE抑制肽的试验本试验考察了DA201-C、HPD-826、DM130、HPD-400、HPD-100、D101、 HPD-800和AB-8八种大孔树脂对猪血红蛋白ACE抑制肽的吸附洗脱效果,发现DA201-C对猪血红蛋白ACE抑制肽的分离效果是最好的,其吸附率为59.83%,解析率为89.78%。因此,选择大孔树脂DA201-C继续接下来的试验。综合考察样品上样浓度、pH、上样流速、乙醇洗脱剂浓度和洗脱剂流速对猪血红蛋白ACE抑制肽的大孔树脂分离纯化效果的影响,最后得出其最佳分离工艺：上样浓度40mg/mL、pH5.0、上样流速0.5mL/min、乙醇浓度75%、洗脱流速1.0mL/min。在此条件下,75%的乙醇洗脱液具有最高的ACE抑制活性,IC50为0.87mg.mL-1,并且该组分的脱盐率为94.52%,疏水值为4.90kJ/mol,最高的芳香族氨基酸含量8.43%。(4)葡聚糖凝胶分离纯化猪血红蛋白ACE抑制肽的试验将经过大孔树脂脱盐纯化的解析液再经过Sephadex LH-20纯化,出现3个组分a-Ⅰ,a-Ⅱ,a-Ⅲ；其IC50分别为：0.64mg-mL-1,0.21mg.mL-4,0.49mg.mL-1,因此,选择ACE抑制活性最高的组分a-Ⅱ进行下一步分离纯化试验。(5)半制备RP-HPLC分离纯化猪血红蛋白ACE抑制肽及其结构鉴定将组分a-Ⅱ进行半制备RP-HPLC分离纯化,发现又分为6个组分,其中组分2-Ⅳ的ACE抑制活性最高,IC50为0.02mg.mL-1。再将组分2-Ⅳ进行氨基酸序列分析,最后得出其序列为Gln-Glu-Leu-Pro-Gly(谷氨酰胺-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸)。(6)猪血红蛋白ACE抑制肽的理化性质研究猪血红蛋白ACE抑制肽(组分a-II)在pH值为7时,具有最低的溶解度,为50.37g/100g；经胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后活性变化不大；在温度为25-55℃时,具有较好的热稳定性；在中性和偏酸性的条件下稳定性较好；在NaCl浓度大于0.6mol/L时,ACE抑制活性急剧降低。本文为西南大学“基本科研业务费专项资金资助项目”(编号：XDJK2009C055)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目“蛋白质生物转化及精制关键技术研究与开发(2013AA102201)”的部分研究内容。