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黏膜系统是机体防御病原微生物入侵的第一道屏障,口蹄疫((Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的高度接触性传染病,黏膜免疫对动物机体防御FMDV入侵有重要意义。本研究分别构建表达牛α干扰素(IFN-α)及FMDV结构蛋白VP1的重组乳酸乳球菌,旨在研究重组乳酸乳球菌作为活载疫苗经黏膜途径免疫动物的效果,为口蹄疫的防控提供新途径。具体研究如下:1.牛IFN-α在乳酸乳球菌中的表达及鉴定根据乳酸乳球菌密码子的偏好性对牛IFN-α的编码基因进行优化合成,与表达载体pNZ8149进行连接后电转化到乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中,经质粒提取、双酶切鉴定、PCR鉴定以及测序分析,筛选出阳性重组菌株,命名为NZ3900/pNZ8149-IFNα。使用诱导剂nisin对其进行诱导表达,SDS-PAGE显示经诱导表达的阳性重组菌株的蛋白带型与未诱导重组菌株和空载体菌株的蛋白带型比较在约20 kDa处可见明显的差异性条带,Western blotting检测有清晰的特异性条带,间接免疫荧光检测可以观测到荧光。以上结果表明IFN-α在乳酸乳球菌NZ3900中得到表达。2.FMDV结构蛋白VP1在乳酸乳球菌中的表达及鉴定提取A型FMDV的RNA,经RT-PCR克隆出VP1基因进行测序分析。根据乳酸乳球菌密码子的偏好性对VP1的编码基因进行优化合成。通过分步PCR在VP1基因的5’端引入乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽编码序列SPusp45,将SPusp45-VP1基因片段连接到表达载体pNZ8148上。连接产物电转化到乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,通过质粒提取、双酶切鉴定、PCR鉴定及测序分析筛选出阳性重组乳酸乳球菌,命名为NZ9000/pNZ8148-SPVP1。使用诱导剂nisin对其进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示阳性重组菌株的蛋白带型在约27 kDa处有差异性条带,Western blotting检测结果证实该蛋白条带可与A型FMDV的豚鼠高免血清发生免疫反应。这表明VP1在乳酸乳球菌NZ9000中得到表达,且具有良好的反应原性。3.重组乳酸乳球菌(NZ9000/pNZ8148-SPVP1)小鼠黏膜免疫效果分析用重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-SPVP1灌服免疫小鼠,共免疫三次,每次连免三天,免疫间隔为一周。设PBS作为阴性对照,NZ9000/pNZ8148作为空载体对照,灭活苗作为阳性对照。样品检测结果显示,实验组肠道黏液中sIgA水平以及血清中IgA明显高于阴性对照组和空载体对照组,血清内特异性IgG抗体水平也有一定的升高;实验组小鼠淋巴细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比值明显大于阴性对照组;小鼠脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显;中和抗体实验结果显示实验组和疫苗组小鼠血清中有一定水平的中和抗体;细胞因子检测结果显示,与阴性对照组相比,实验组的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的量都有不同程度的增高,其中实验组IL-4、IL-5和IL-10与阳性组和阴性组相比增高明显,差异性极显著。以上结果表明,表达VP1蛋白的重组乳酸乳球菌经口服免疫小鼠不仅诱导机体产生相应的体液免疫应答而且可以诱导机体产生相应的黏膜免疫应答和细胞免疫应答。这为FMD新型口服疫苗的研究提供了实验基础。