三氧化二砷对Hut78细胞SHP-1基因去甲基化作用的研究

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目的:1.检测Hut78细胞中抑癌基因SHP-1启动子的甲基化状态。2.倘若SHP-1基因启动子高甲基化,检测Hut78细胞在As2O3处理前后SHP-1启动子甲基化状态的变化、SHP-1mRNA和蛋白的表达情况以及细胞增殖凋亡情况,探讨As203的去甲基化作用及对Hut78细胞的生物学影响,为As203应用于治疗进展期MF/SS提供实验基础。方法:1.应用MSP检测Hut78细胞中SHP-1基因启动子的状态。2.应用MSP检测As203处理前后Hut78细胞中SHP-1基因启动子甲基化状态的变化。3.应用Real-time PCR分析As203处理前后Hut78细胞中SHP-1mRNA表达的变化。4.应用Western Blot分析As2O3处理前后Hut78细胞中SHP-1蛋白表达的变化。5.应用MTT比色法检测As203对Hut78细胞的增殖抑制作用。6.应用Annexin V/PI标记流式细胞术检测As203对Hut78细胞凋亡的影响。7.应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析,多个样本均数经单因素方差分析后,若有统计学意义,进一步采用LSD-t检验两两比较,均以双侧检验、P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.MSP结果显示,Hut78细胞中SHP-1基因启动子仅有甲基化条带,无非甲基化条带。2.MSP结果显示,5.0μmol/L As2O3作用Hut78细胞,随着作用时间的延长(24h、48h、72h),SHP-1基因的甲基化条带逐渐减弱,非甲基化条带逐渐增强。3. Real-time PCR结果显示,随着As203作用浓度的增加(2.5μmol/L.5.0μmol/L、7.5μmol/L)和作用时间的延长(24h、48h、72h),Hut78细胞中SHP-1mRNA的表达逐渐增强(P<0.05)。4. Western Blot结果显示,未处理的Hut78细胞中检测不到SHP-1蛋白的表达,5.0μmol/L As2O3作用Hut78细胞,随着作用时间的延长(24h、48h、72h), SHP-1蛋白表达逐渐增强(P<0.05)。5.MTT结果显示,As2O3明显抑制Hut78细胞的增殖,且抑制作用随作用浓度的增加(2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L)和作用时间的延长(24h、48h、72h)而逐渐增强(P<0.05)。6.流式细胞术检测发现,As2O3可诱导Hut78细胞诱导,且细胞凋亡率随As2O3作用浓度的增加(2.5μmol/L、5.0μmol/L、7.5μmol/L)和作用时间的延长(24h、48h、72h)而逐渐增加(P<0.05)。结论:1.Hut78细胞中SHP-1基因启动子处于完全甲基化状态,导致SHP-1基因缄默。2.As2O3能通过去甲基化作用诱导Hut78细胞中SHP-1mRNA和蛋白的重新表达,从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。As2O3有望成为治疗进展期MF/SS的有效药物。
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