应用OsMSL5基因提高水稻抗盐耐旱能力的研究

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水稻(Oryza sativa L.)在解决人类温饱问题上扮演着重要的角色。植物细胞能感知机械刺激中的渗透压变化,并做出响应。机械敏感离子通道蛋白提供了一个保守的机制,即通过传导离子来调节渗透压。Msc S-like(Mechanosensitive channel of small conductance-like,MSL)蛋白家族作为离子通道家族在膜张力增加时通道打开,不仅可以提高植物的抗盐、耐旱能力,对低温胁迫也有一定的响应。OsMSL5是水稻MSL蛋白家族中的一员,其功能尚未见报道。因此,深入研究OsMSL5基因的生物学功能,可进一步丰富MSL蛋白家族的功能。本研究主要以OsMSL5的T-DNA插入突变体(osmsl5)和过表达株系(OsMSL5-OE)为研究材料,探究OsMSL5作为渗透安全阀直接感知膜张力的变化、传导离子来调节植物的水分和渗透平衡、参与水稻的生长发育和应对逆境胁迫的能力。主要研究工作及结果如下:(1)通过软件GENEVESTIGATOR预测分析OsMSL5的时空差异表达模式,我们发现OsMSL5尤其在水稻苗期和成熟期高表达,而在分蘖期和抽穗期表达水平较低;在愈伤组织、细胞培养/原代细胞、幼苗、花序、颖果、根茎中表达水平较高,而在圆锥花序细胞、芽中表达水平较低。通过q RT-PCR分析结果表明,OsMSL5受ABA诱导,表达量上调,同时也受非生物胁迫信号如Na Cl和PEG诱导上调表达。亚细胞定位结果表明,OsMSL5作为膜蛋白主要定位于高尔基体、内质网和细胞膜中。(2)OsMSL5的功能缺失造成水稻的主根长度降低、侧根数量减少、侧根密度降低、不定根数量减少和平均不定根长度降低;osmsl5突变体植株在成熟期植株矮化,同时分蘖数量增加。因此,OsMSL5在水稻的生长发育中起重要作用。(3)OsMSL5能维持低渗胁迫下细胞大小。水稻和烟草原生质体细胞对渗透压响应的研究结果表明:在等渗条件下,野生型(DJ)和osmsl5突变体水稻原生质体细胞无明显差异;在低渗条件下,野生型(DJ)和osmsl5突变体水稻原生质体细胞体积变大,但与野生型相比,osmsl5突变体的原生质体的体积增大更为显著。同样,等渗条件下,瞬时表达GFP或OsMSL5-GFP融合蛋白的烟草原生质体细胞大小没有显著差异;而在低渗条件下,瞬时表达GFP或OsMSL5-GFP融合蛋白的烟草叶片原生质体细胞体积均增大,但表达GFP的细胞体积增大更为显著。(4)OsMSL5的功能缺失降低水稻对高盐和干旱的耐受性。胁迫试验结果表明:Na Cl或PEG能抑制野生型(DJ)和osmsl5突变体植株的生长,但对osmsl5抑制程度显著大于野生型。生理指标检测结果显示:高盐和干旱处理后,osmsl5植株中的丙二醛(MDA)含量和相对电导率均高于野生型,而脯氨酸含量显著低于野生型。DAB和NBT染色结果表明,高盐和干旱处理后,osmsl5叶片中活性氧(ROS)的积累水平更高。q RT-PCR分析表明,在Na Cl和PEG胁迫处理后,相较于野生型,osmsl5突变体植株体内活性氧合成基因的表达水平更高,而活性氧清除基因的表达水平更低。(5)OsMSL5的功能缺失降低水稻对脱落酸(abscisic acid,ABA)的敏感性。离体叶片失水率测定结果表明,干旱处理后,osmsl5突变体植株的水分流失速度比野生型(DJ)更快。气孔开合度研究结果表明,ABA处理后,野生型叶片完全关闭的气孔比例显著高于osmsl5。q RT-PCR分析结果表明,在高盐渗透胁迫和干旱胁迫处理后,相较于野生型,osmsl5突变体中ABA代谢基因的表达水平更高;此外,对依赖于ABA路径的胁迫响应基因Os HKT1和Os RAB11的表达量分析表明,胁迫处理后,相较于野生型,osmsl5突变体植株体内Os HKT1和Os RAB11的表达水平更低。(6)OsMSL5的表达量会影响水稻的花粉发育。构建过表达载体并获得过表达转基因植株(以下简称OsMSL5-OE)。与野生型(DJ)相比,osmsl5突变体的雄蕊发育异常,花粉囊呈现畸形而且干瘪;而OsMSL5-OE的雄蕊发育正常,花粉囊呈现饱满的形态。以上结果表明:OsMSL5作为渗透安全阀去感知极端渗透环境,同时也作为膜张力传感器去响应膜张力的增加,维持细胞的大小和形态,影响水稻生长发育以及逆境胁迫下的适应性。
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