目的：　　 本文在已成功克隆、表达及实验室小规模制备hIL-15-SA的基础上,采用发酵罐发酵生产,镍柱亲和层析及阴离子交换层析纯化,研究hIL-15-SA中试制备工艺,为进一步工业化生产奠定了基础。　　 方法：　　 1.诱导表达hIL-15-SA融合蛋白　　 用CaCl2方法制备Rosetta感受态细胞,从大肠杆菌DH5a中提取质粒pET21a-hIL-15-SA(由本室保存),将质粒转化入感受态细胞中进行活化,IPTG诱导表达,超声破菌,包涵体洗涤。应用SDS-PAGE分析检测表达产物。　　 2.hIL-15-SA融合蛋白发酵条件优化　　 根据Rosetta,细菌的性质以及载体的特性将发酵培养基成分(蛋白胨,酵母抽提物,硫酸铵,硫酸镁,甘油)进行优化分析,并分别对培养基的pH值,IPTG诱导浓度,接种量进行优化。并通过BIO-FLO发酵系统对整个发酵过程(溶氧度,pH,温度等)进行监控。　　 3.包涵体洗涤,纯化复性　　 收集工程菌,通过细胞压力破碎仪破菌收得包涵体后,计算包涵体得率,包涵体经过洗涤后用8M尿素溶解进行二步纯化(镍柱亲和层析,离子交换层析)得到融合蛋白,通过银氨染色,凝胶成像扫描方法检测其纯度,并将融合蛋白进行透析复性。　　 4.细胞增殖实验和细胞锚定实验　　 将复性的hIL-15-SA融合蛋白调整不同浓度体外检测是否对淋巴细胞有增殖效应,并应用流式细胞仪检测hIL-15-SA对前列腺癌细胞RM1的锚定率,初步评价经中试研究后hIL-15-SA融合蛋白的生物学活性。　　 结果：　　 1.诱导表达hIL-15-SA融合蛋白　　 将质粒pET21a-hIL-15-SA导入大肠杆菌中在带有氯霉素和氨苄霉素抗性的平板中,经过16℃,18h孵育后生长出单克隆菌落,并在菌落活化时间为5h,37℃,220rpm,0.3mM IPTG条件下诱导表达。经SDS-PAGE鉴定蛋白出现约34KD大小位置。　　 2.hIL-15-SA融合蛋白发酵条件优化　　 通过发酵条件的优化,在3％的接种量,pH值为7.2,发酵培养基为20g/L蛋白胨,40g/L酵母抽提物,4g/L磷酸二氢钠,12g/L磷酸氢二钠,3g/L硫酸铵,2g/L硫酸镁,4ml/L甘油发酵条件下一次性可得到湿菌47g/L和包涵体21.15g/L。　　 3.包涵体洗涤,纯化复性　　 洗涤液洗后的包涵体用8M尿素溶解后分别经镍柱层析和阴离子交换柱层析,纯化后的目的条带经SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定。条带经银氨染色及经凝胶扫描仪分析纯度为97％,二次纯化后目的条带峰值最高浓度为1.3mg/ml。纯化后的融合蛋白通过梯度尿素透析复性的方法检测体外生物学活性。　　 4.细胞增殖实验和细胞锚定实验　　 取小鼠脾细胞,体外MTT法检测发现不同浓度的hIL-15-SA与淋巴细胞成剂量依赖效应,流式细胞仪检测hIL-15-SA融合蛋白与经生物素化的RM1肿瘤细胞锚定率达到99.7％。　　 结论：　　 本文成功的将pET21a-hIL-15-SA质粒导入大肠杆菌中并进行发酵获得大量工程菌和包涵体,通过二次纯化获得高浓度和高纯度的融合蛋白,并在体外细胞增殖实验和细胞锚定实验中初步检测了经发酵过的hIL-15-SA双功能融合蛋白具有生物学活性。进一步为后续的体内生物学作用以及工业化生产奠定基础。