高效液相色谱体内药物分析过程通常包括四个主要步骤：样品制备、分离分析、检测、数据处理，其中样品制备常为限速步骤。液—液萃取和固相萃取作为常用的样品制备技术均在离线状态下进行，准确度和精密度不高，操作繁琐，耗时费力，无法测定结构不稳定药物的含量。为此已开发出一些在线快速样品制备方法，其中颇具吸引力的是引入特异的色谱填料，即限进填料(RAM)。这种填料可直接、重复进样分析复杂的体内样品。在单柱或柱切换模式下应用此填料后，液相色谱系统样品制备过程可自动化、简便化和快速化，进而实现体内药物的直接进样分析。 为考察限进高效液相色谱方法在体内药物分析中的普遍适用性，本实验采用限进填料结合单柱或柱切换系统，分别建立对极性的特布他林、非极性的替米沙坦和结构不稳定的拓扑替康进行血药浓度测定的方法。 1、限进填料高效液相色谱法测定人血浆中特布他林的浓度 为建立限进高效液相色谱测定人血浆中特布他林浓度的方法，直接进特布他林血浆样品到液相色谱系统测定其浓度。色谱柱为限进填料柱(150mm×4.6mm，5μm)：柱温：40℃；流动相：甲醇—0.05M辛烷磺酸钠溶液(含0.005M磷酸二氢钠并用磷酸调pH至3.5)=5∶95(v／v)；流速：0.8ml／min；进样量：20μl；荧光检测λex280nm／λem309nm。平均回收率为94.50％，校正曲线线性范围为1～40μg／ml(r=0.9996)。日内和日间的平均RSD分别为2.53％，2.80％。最低检测浓度为0.1μg／ml。本法准确、简便、快速，适用于特布他林的血药浓度测定及其药动学研究。