背景与目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一近年来随着人民生活水平提高和社会结构老龄化倾向,其发病率有增高趋势。结直肠癌侵袭转移的发生是导致患者死亡的主要原因。多年来为了探讨其发病机制、早期诊断和有效的治疗方法,人们进行了大量的研究,取得了一定的进展。但其发病原因尚未完全清楚。CD137/CD137L (4-1BB/4-1BBL)是细胞免疫应答过程中一对重要的共刺激分子,它们在活化的T细胞与抗原递呈细胞之间发挥双向信号转导(bidirectional signal transduction)作用,在特异性细胞免疫应答的维持及免疫记忆方面有特殊的生物学意义。CD137 (4-1BB, ILA)属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族,生要表达于活化的T细胞表面。其配体CD137 ligand (CD137L)属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族,主要表达于抗原递呈细胞表面,如单核细胞、树突状细胞、B细胞、巨噬细胞。CD137与CD137L交联后产生T细胞活化所必须的共刺激信号,协同CD28/B7信号促进T细胞的活化。在CD28/B7信号缺失时,CD137亦可独立介导T细胞活化所需的共刺激信号,对启动CD28-T细胞的免疫应答有重要作用。CD137不但可以活化T细胞,还可以保护T细胞免于活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)。近年来越来越多的研究者开始关注CD137L的逆向信号转导(reverse signal transduction)。运用固定化的CD137分子活化单核细胞表面的CD137L,能显著增强单核细胞的增殖,增强促炎症细胞因子如][NF、IL-6、IL-8、IL-12的分泌。体内及体外实验均证实CD137L能够诱导单核细胞表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1),进而显著增强单核细胞的迁移活性。Drenkard等发现促炎症因子能诱导炎症部位的血管内皮细胞表面CD137分子的高表达,进而诱导单核细胞向炎症部位迁移。体外研究发现CD137L在促进单核细胞分裂增殖的同时,也增高了单核细胞的凋亡率,但细胞凋亡现象被细胞增殖现象掩盖了,因此总体上细胞还是表现为增殖的状态。CD137L还能对已活化的B细胞发挥调节作用,促进其细胞增殖及免疫球蛋白的分泌。但CD137L信号如果持续存在,则下调B细胞的数量及功能。人外周血单核细胞经CD3单抗活化后能够通过细胞间接触产生的CD137/CD137L信号交联而诱导B细胞凋亡。此外,活化的T细胞表面也表达CD137L,向T细胞传递凋亡信号,并且其诱导T细胞凋亡并不依赖CD95。研究发现CD137L可组成性表达于Raji、Daudi、Colo 205、HCT 116、HT 29、LX 1、PC 3、SKBR细胞及人体肿瘤组织细胞。肿瘤细胞株表面的CD137L具有一定的生物学功能,应用固定化的CD137活化CD137L,能促进肿瘤细胞分泌IL-8。HCT 116、HT 29与T细胞在加入CD3单抗的培养基中共同培养时,能显著促进T细胞分泌IFN-γ,并且IFN-γ的分泌量与肿瘤细胞的数量及细胞表面CD137L的表达水平呈正相关。人T细胞白血病细胞株CEM及人B细胞系淋巴瘤细胞株Raji细胞表面表达CD137及CD137L,体外实验发现通过激活其表面的CD137L或CD137能够促进细胞增殖、降低细胞凋亡、减弱抗癌药物的细胞毒效应。最近一项研究运用冰冻免疫组化技术检测了36例恶性肿瘤原发灶中CD137及CD137L的表达情况,发现15例CD137的表达为阳性(染色细胞数大于10%),21例CD137L的表达为阳性；其中16例中低分化的肿瘤组织,11例CD137的表达为阳性,12例CD137L的表达为阳性。并且,CD137表达于肿瘤组织血管平滑肌细胞及内皮细胞表面,CD137L表达于肿瘤细胞表面。而在15例人体良性肿瘤组织中,仅2例检测出CD137的阳性表达,3例检测出CD137L的阳性表达,在12例正常组织中均未能检测出这两个分子的表达。CD137L从细胞表面清除的过程中释放出可溶性CD137L(soluble CD137L,sCD137L),其释放过程可以被基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitor, MMPI)阻断。Salih等发现sCD137L在健康人的血清中的表达水平很低(3.2pg/ml),而在恶性血液病患者血清中sCD137L浓度显著升高,31例非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)、52例骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome, MDS)、20例急性髓细胞性白血病(acute myeloic leukemia, AML)患者血清sCD137L的平均值分别为57pg/ml、210pg/ml、682 pg/ml。高浓度的sCD137L可能通过与膜表面CD137L竞争结合位点,从而抑制了免疫细胞与抗原呈递细胞之间共刺激活化信号的转导,使机体的细胞免疫应答功能受损,同时也减弱了肿瘤细胞膜表面CD137L的信号传导,可能有助于肿瘤细胞逃逸机体免疫系统的监视。高浓度的sCD137L随循环到达远端的组织器官,也可能是这些恶性血液病某些病理生理变化的原因之一。进一步研究发现血清sCD137L的浓度与疾病的转归有一定关系,血清sCD137L高浓度与MDS的迅速进展有关,而血清sCD137L浓度低的患者无进展生存时间较长。对42例AML患者的研究发现,M1/M2型AML患者血清sCD137L浓度均值为1470 pg/ml,明显高于M4/M5型AML(89 pg/ml),并且浓度低的患者治疗后较易取得完全缓解。一般认为在肿瘤的发生发展过程中,肿瘤细胞通常低表达或不表达共刺激分子从而逃避机体免疫系统的识别。人结肠癌细胞株Colo 205、HT 29、HCT 116以及多种肿瘤组织细胞表面均表达CD137L,并且该分子具有的生物学活性,能促使肿瘤细胞增殖、分泌IL-8,降低细胞凋亡,减弱抗癌药物的细胞毒效应。CD137L表达于多种人体肿瘤组织细胞表面,CD137则表达于肿瘤组织血管壁,因此我们推测CD137/CD137L这一对共刺激分子在肿瘤微环境中发挥一定作用,通过双向信号转导对肿瘤的发生、进展及转移可能具有特殊的生物学意义。我们运用实时荧光定量RT-PCR及冰冻免疫组化法检测结直肠癌组织CD137L的表达,探讨这两项指标与各临床病理因素之间的关联性,揭示CD137L在结直肠癌发展中的可能作用,为寻找结肠癌新的分子标志物及治疗靶点奠定基础；运用固定化CD137/Fc刺激CD137L高表达结肠癌细胞株Colo 205,然后运用CCK-8检测细胞增殖,ELISA法检测培养上清中IL-8的浓度,Transwell实验检测细胞体外侵袭力,明胶酶谱法分析培养上清中MMP-9的含量,Western blotting分析Akt、phospho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表达,进一步揭示CD137L对肿瘤细胞的生物学作用,初步探讨其可能机制。方法1.收集2007年10月～2008年4月我院手术切除的结直肠癌组织标本54例及距离肿瘤边缘10cm处癌旁组织标本18例,肿瘤组织经病理检查均为腺癌。54例患者中男性29例,女性25例,年龄22～84岁,中位年龄60岁。结肠癌38例,直肠癌12例,直肠乙状结肠交界癌4例。28例有淋巴结转移。组织切除后30m内采集标本,放入冻存管,浸泡在RNAlater(?)中,4℃过夜后,-80℃保存待测,用于实时荧光定量RT-PCR检测CD137L mRNA的表达。2.同时切取黄豆大小肿瘤组织及癌旁组织,加少许冰冻切片包埋剂用铝箔包裹,浸没于液氮中速冻成块后置-80℃保存,用于冰冻切片免疫组化检测CD137L蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织的表达。3.由2位病理医师在不知道任何临床和病理资料的情况下对免疫组织化学检测结果进行评估。免疫组化结果判断采用半定量的方法。染色强度无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。计数阳性细胞比例,<5%为0分,5～10%为1分,11～50%为2分,>50%为3分。将染色强度得分与阳性细胞得分相乘,0分为“—”,1～2分为“+”,3～5分为“++”,6分以上为“+++”。我们将“-～+”定义为蛋白低表达,将“++～+++”定义为蛋白高表达。采用χ2检验分析CD137L蛋白表达与各临床参数之间的关系。4.运用流式细胞术检测本室保存的结肠癌细胞株Colo 205细胞表面CD137L的表达。为进一步探讨CD137L在结肠癌组织微环境中可能发挥的作用,运用结肠癌细胞株Colo 205进一步研究CD137L对肿瘤细胞可能发挥的生物学作用。5.Colo 205细胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培养板中培养24h、48h、72h后,运用CCK-8法测定细胞的增殖情况。6.Colo 205细胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培养板中培养48h后,ELISA法检测培养上清中IL-8的浓度。7. Matrigel中分别加入CD137/Fc(终浓度为2μg/ml)或Human IgG1 Fc(终浓度为1μg/ml),然后包被到transwell小室底部膜的上室面。Colo 205细胞加入transwell上室,培养48h后,将小室取出,轻轻擦去上室内未穿过滤膜的细胞,固定染色后,在200倍光镜下随机取5个视野计数穿透细胞,其均值代表侵袭力。8. Colo 205细胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培养板中培养48h后,明胶酶谱法分析培养上清中MMP-9的含量。9. Colo 205细胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培养板中培养12h后,Western blotting分析Akt、phospho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表达情况。结果1.运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测54例结直肠癌组织及18例癌旁组织中CD137L mRNA的表达,结果显示结直肠癌组织中CD137L mRNA的相对表达量为0.035±0.013,显著高于癌旁组织的0.008±0.005 (Welch校正后F’=146.009,P=0.000)。但结肠癌、直肠癌及直乙交界癌的CD137LmRNA的表达水平没有统计学差异(F=1.560,P=0.220)。不同性别、年龄、Dukes分期、有或无淋巴结转移的患者,其肿瘤组织CD137L mRNA的相对表达量无显著性差异(P值均大于0.05)。2.运用冰冻免疫组化检测54例结直肠癌组织及18例癌旁组织中CD137L蛋白的表达,结果显示癌旁组织CD137L蛋白的表达16例为“-”,2例为“+”。结直肠癌肿瘤组织CD137L蛋白表达的总阳性表达率为88.9%(48/54),各级表达比例为：“-”占11.1%(6/54),“+”占18.5%(10/54),“++”占37.0%(20/54),“+++”占33.3%(18/54)。3.在54例结直肠癌患者中,男性29例,女性25例,CD137L高表达者分别为21例、17例,高表达率分别为72.4%、68.0%,两者之间无显著性差异(χ2=0.125,P=0.772,双侧)。患者年龄≥60岁的27例,<60岁的27例,CD137L高表达者分别为17例、21例,CD137L在不同年龄组中的高表达率分别为63.0%、77.8%,两者之间无显著性差异(χ2=1.421,P=0.372,双侧)。淋巴结转移患者为28例,未发现淋巴结转移患者为26例,CD137L高表达者分别为18例、20例,高表达率分别为64.3%、77.0%,两者之间无显著性差异(χ2=1.033,P=0.379,双侧)。54例结直肠癌患者中,结肠癌38例,直肠癌及直肠乙状结肠交界癌16例,CD137L高表达者分别为28例、10例,高表达率分别为73.7%、62.5%,两者之间无显著性差异(χ2=0.675,P=0.517,双侧)。4.在54例结直肠癌患者中,6例为Dukes A期,16例为Dukes B期,12例为Dukes C期,20例为Dukes D期,CD137L高表达例数分别为1例、13例、11例、13例,CD137L在各分期中的高表达率分别为16.7%、81.2%、91.6%、65.0%,统计学分析示各Dukes分期之间CD137L的高表达率有显著性差异(χ2=12.094,P=0.007)。5.Colo 205细胞在CD137/Fc或IgG1 Fc包被及未包被的培养孔中培养24h、48h、72h后,加入CCK-8试剂,测定细胞增殖情况。析因分析示不同培养条件下,在不同培养条件下各组细胞的增殖情况有显著性差异(F=231.548,P<0.001)；各组细胞在不同培养时间后细胞增殖情况有显著性差异(F=98.579,P<0.001)；但培养条件与培养时间之间没有显著性交互效应(F=0.726,P=0.585)。经两两比较显示,培养24h、48h及72h后,CD137/Fc组细胞增殖与空白组及IgG1 Fc组相比均显著增强；IgG1 Fc组细胞增殖情况与空白组相比无显著性差异。6. Colo 205细胞在CD137/Fc或IgG1 Fc包被及未包被的培养孔中培养48h后,采集培养上清,ELISA测定IL-8的浓度。结果显示,培养48h后,空白组、CD137/Fc组及IgG1 Fc组的Colo 205细胞,IL-8的浓度有显著性差异(F=68.585,P=0.000)。CD137/Fc组的Colo 205细胞培养上清中IL-8的浓度为195.3±24.3ng/ml,显著高于IgG1 Fc组及空白组(P值均为0.000)IgG1 Fc组培养上清中IL-8的浓度为52.7±11.4ng/ml,空白组培养上清中IL-8的浓度为54.7±12.5ng/ml,两组IL-8浓度无显著性差异(P=0.891)7.侵袭实验结果显示,培养48h后,空白组、CD137/Fc组及IgG1 Fc组的透膜细胞数有显著性差异(F=47.988,P=0.000)。CD137/Fc组的透膜细胞数为105±10个/视野,显著高于IgG1 Fc组及空白组(P值均为0.000)。IgG1 Fc组的透膜细胞数为57±3个/视野,空白组透膜细胞数为60±6个/视野,两组无显著性差异(P=0.602)。8. Colo 205细胞在CD137/Fc或IgG1 Fc包被及未包被的培养孔中培养48h后,采集培养上清,明胶酶谱法检测上清中MMP-9的表达。根据pro-MMP-9条带灰度及面积计算酶的表达量,分析结果显示三组细胞pro-MMP-9表达有显著性差异(F=14.593,P=0.005)。CD137/Fc组,酶的表达量为81.33±6.11,显著高于IgG1 Fc组及空白组(P值分别为0.004和0.003)。IgG1 Fc组的表达量为58.00±6.25,空白组的表达量为59.00±5.57,两组无显著性差异(P=0.845)9.Colo 205细胞在CD137/Fc或IgG1 Fc包被及未包被的培养孔中培养12h后,分析细胞中Akt、phospho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表达情况。结果显示,各组Colo 205细胞Akt的表达水平没有显著性差异(F=0.128,P=0.882)；各组Colo 205细胞phospho-Akt的表达水平有显著性差异(F=34.403,P=0.001)。CD137/Fc组的Colo 205细胞phospho-Akt的表达水平显著高于IgG1 Fc组及空白组(P值均为0.000)；IgG1 Fc组细胞与空白组细胞phospho-Akt的表达水平无显著性差异(P=0.505)。各组Colo 205细胞p38的表达水平没有显著性差异(F=0.282,P=0.764)；各组Colo 205细胞phospho-p38的表达水平有显著性差异(F=22.110,P=0.002)。CD137/Fc组Colo 205细胞phospho-p38的表达水平显著高于IgG1 Fc组及空白组(P值均为0.001)；IgG1 Fc组细胞与空白组细胞phospho-p38的表达水平无显著性差异(P=0.964)。各组Colo 205细胞ERK及phospho-ERK的表达水平均没有显著性差异(F值分别为1.845及1.288,P值分别为0.237及0.342)。结论1. CD137L mRNA及蛋白在结直肠癌肿瘤组织中表达显著高于癌旁组织,CD137L蛋白表达于结直肠癌肿瘤细胞表面,且在Dukes C期、Dukes B期的表达最强,Dukes D期次之,Dukes A期最弱,提示该分子可能在结直肠癌的发生进展中有特殊的生物学意义。2.CD137L蛋白在癌旁组织的表达率很低,而在结直肠癌肿瘤组织中高表达,说明该分子具有一定的成为结直肠癌诊断性肿瘤标志物的临床价值。3.体外实验中,CD137L通过逆向信号能显著促进Colo 205细胞的增殖、IL-8分泌及MMP-9的表达,增强细胞的侵袭性；进一步的研究发现CD137L分子能增强Colo 205细胞phospho-Akt及phospho-p38的表达,提示CD137L分子可能在结直肠癌的发生进展及转移中发挥重要作用。本研究的创新之处1.我们运用实时荧光定量RT-PCR、免疫组化法检测54例人结肠癌组织CD137L的表达,发现CD137L mRNA及蛋白在结直肠癌组织中呈高表达,CD137L蛋白表达于结直肠癌肿瘤细胞表面,在Dukes C期、Dukes B期的表达最强,Dukes D期次之,Dukes A期最弱。2.体外运用固定化CD137/Fc活化Colo 205细胞表面的CD137L,发现CD137L通过逆向信号能显著增强Colo 205细胞的增殖、IL-8分泌及MMP-9的表达,提高细胞侵袭力,增强Colo 205细胞phospho-Akt及phospho-p38表达,初步揭示了CD137L对Colo 205细胞生物学功能及其可能机制。