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食源性肽是指以动植物蛋白为原料(包括豆类、谷类、鱼类、禽类等),通过酶解或发酵后而形成的小分子肽类的总称。本文以食源性肽BP253和BP701为原料,展开了一系列研究。首先,优化了食源性肽BP253与铁盐的螯合工艺,得出一种得率较高的肽铁螯合物制备工艺,这为开发一种新型的补铁剂奠定了基础。其次,因Caco-2细胞模型是研究营养物质吸收情况的经典模型,但用正常培养基培养Caco-2细胞模型需要21天,所以将BP701和促分化剂BA作用于Caco-2细胞模型,旨在建立一种周期短、节约时间和原材料的新型Caco-2单层细胞模型。主要研究结论总结如下:1、利用单因素试验和响应面分析法设计试验,优化食源性肽BP253与铁盐螯合制备肽铁螯合物的最佳工艺。响应面分析采取Box-Behnken中心组合设计原理,利用三因素三水平,以肽铁螯合物的得率为响应指标,选择肽浓度、肽铁质量比、pH为响应面分析的实验因素,最终得到肽铁螯合物制备的最佳工艺参数为肽浓度40 mg/mL,肽铁质量比为4.5:1,螯合温度为45℃,螯合时间为50 min,反应pH值为7.0,肽铁螯合物的得率为11.48%。2、为了得到Caco-2细胞的最佳消化条件,研究了胰蛋白浓度、消化温度对Caco-2细胞消化效果的影响。实验证明胰蛋白浓度和消化温度是影响Caco-2细胞消化所需时间和效果(消化后单细胞比例)的主要因素,其中0.25%的胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2、37℃、消化时间3 min为消化Caco-2细胞的最佳条件。3、采用MTT法研究不同种类的食源性肽对Caco-2细胞增殖率(作用时间为24 h)的影响,筛选出了 BP701对Caco-2细胞的增殖率达42.66%。其次,研究了不同浓度的BP701(5、50、100、200、400 μg/mL)对Caco-2细胞增值率的影响,其中200 μg/mL的BP701、对Caco-2细胞的增殖作用最强。4、研究了不同浓度的BP701对Caco-2细胞生长曲线的影响,设置空白组和实验组,研究了 Caco-2细胞自身的生长周期 从而对Caco-2细胞的生长特性有基本了解,进一步保证了该实验的准确性和稳定性。研究表明浓度在5～200 μg/mL范围内的BP701对Caco-2细胞均有不同程度的促增殖作用,且对对数生长期的Caco-2细胞的增殖作用最为明显,缓慢增长期的促增殖作用明显低于对数期,平稳期其增殖作用逐渐减弱,但不改变Caco-2细胞的自然生长规律。5、研究了 BP701对Caco-2细胞模型建立的影响,通过酚红透过率和AKP活力测定来判断Caco-2细胞模型建立是否成功。结果表明,随着Caco-2单层细胞模型培养时间的增加,酚红透过率逐渐降低,至第9天后趋于平稳(8.03%)。而用正常培养基培养的Caco-2单层细胞模型其酚红透过率在模型建立第15天后才趋于平稳(8.19%),这说明BP701能有效促进Caco-2细胞单层膜的形成。在Caco-2细胞模型建立21天时,AP/BL=1.124,说明Caco-2细胞只生长不分化。该研究表明,BP701的加入可以促进Caco-2细胞快速形成一层致密的膜,但不能促进其分化。6、采用MTT法测定不同浓度的血清背景下促分化剂BA对Caco-2细胞的毒性作用,5mmol/L和2mmol/L的BA0(血清浓度为0)、5mmol/L和2 mmol/L的BAfBS(含16.5%的血清)对Caco-2细胞的存活率均没有明显的影响,但当促分化剂BA的浓度为10 mmol/L时,则对Caco-2细胞有明显的毒性作用。7、考察了 2 mmol/L的BAo和BAFBS对Caco-2细胞模型建立的影响。在Caco-2细胞模型建立17天时加入2 mmol/L的BAo和BAfBs作用5天。AKP活力测定结果表明,在BA0和BAfBs作用Caco-2单层细胞模型5天后,BA0和BAFBS均使AP侧的AKP活性明显高于BL侧,表明Caco-2单层细胞模型出现了不同程度的极化现象。但BA0(AP/BL=15.46)明显比BAFBS(AP/BL=4.394)更能促进Caco-2单层细胞模型的分化,BA0培养的Caco-2单层细胞模型的分化程度与正常培养基培养21天所得的单细胞层一致(AP/BL=14.50),这说明BA0作用于Caco-2单层细胞模型仅5天即可达到良好的分化效果。因此,后续实验选择2 mmol/L的BA0用于Caco-2单层细胞模型的建立。8、研究了 2 mmol/L的BA0加入的时间点对Caco-2细胞模型建立的影响,通过在显微镜下观察细胞形态、酚红透过率测定、AKP活力测定确定BA0加入的时间点。Caco-2细胞模型建立第5天时加入BA0并对其作用五天后,在显微镜下观察Caco-2单层细胞模型建立第9天部分细胞出现裂解,酚红透过率随着时间的增加反而增大,AP侧和BL侧的AKP活力比值较小(AP/BL=2.380),这表明在Caco-2细胞模型建立第5天时加入BA0对其作用五天不利于成功建立该模型。而在Caco-2细胞模型建立第14天时加入BA0并对其作用五天后,在显微镜下观察,Caco-2细胞已经形成了一层致密平整的膜,酚红透过率也仅有8.38%,AP侧的AKP活力是BL侧的14.94倍,表明在Caco-2细胞模型建立第14天时加入BA0,Caco-2细胞模型仅需要18天就可以建立成功,这与标准Caco-2细胞模型建立需21～22天相比,既节省了实验材料又节省了时间。