在世界范围内,脑卒中是主要致死疾病,且为首要致残疾病,而缺血性卒中占大多数。迄今,只有一种FDA批准的直接治疗方法用于严重缺血性卒中——重组组织型溶酶原激活剂(rt-PA),溶栓后使血管再通,血流恢复。尽管溶栓的治疗效果明确,但治疗时间窗口较窄,仅3-4.5h,超时间窗后应用不但疗效降低,且将增加继发性出血的风险,仅小部分患者适合接受rt-PA治疗。发生缺血性脑卒中后,局部脑血流中断,在几分钟内即造成缺血脑组织损伤和部分神经功能缺失。缺血脑组织根据缺血程度不同可以分为缺血核心区与半暗带。脑缺血发生后,能量耗竭,糖氧缺失,造成ATP产量急剧下降,从而引起乳酸性酸中毒和离子稳态失衡等。同时这些反应会引发下游的由多种细胞类型参与的"瀑布式"级联反应,导致兴奋性毒性并诱发调亡。坏死的神经元可大量激活脑内免疫细胞,并伴随血-脑屏障的破坏,外周的免疫细胞也因此通过被破坏的血-脑屏障进入中枢,与脑组织中的原位免疫性细胞一同参与到脑卒中病理进程中。其中,外周血来源的单核-巨噬细胞与激活的小胶质细胞在脑卒中的炎症反应进程中起重要作用,巨噬细胞在局部炎症微环境条件下可极化为广义上有促炎作用的M1型或抗炎作用的M2型。减少卒中后急性期炎症细胞的激活/浸润、抑制巨噬细胞/小胶质细胞极化为M1并促进极化为M2,对于减轻脑卒中后的神经元坏死、脑组织水肿及炎症反应有重要意义。甲异靛玉红简称甲异靛,是靛玉红衍生物,其溶解度和临床疗效均优于靛玉红,不良反应较轻,自20世纪80年代起逐渐成为我国慢性粒细胞白血病(CML)临床治疗的常用药物。甲异靛可以在μM浓度级别抑制多种白血病细胞的增殖、并可促进凋亡。甲异靛作用的分子机制尚不完全明确,它可抑制白血病细胞DNA生物合成与微管组装。前期体内研究发现甲异靛可抑制白细胞向损伤处趋化性迁移,从而减轻局部炎症反应。但此种作用是否能抑制CIRI后外周炎症细胞向中枢的浸润,减轻急性期炎症反应,从而改善CIRI及作用机制,是否有作为一种神经保护药物的潜能,需要进一步挖掘。本文通过建立小鼠t MCAO模型,研究甲异靛对脑缺血再灌注损伤的保护作用,和对巨噬细胞/小胶质细胞极化的调节作用,引入MCC950作对比,验证甲异靛对脑缺血再灌注损伤后NLRP3炎症小体表达的抑制作用,结合甲异靛对缺血半暗带炎症细胞激活/浸润的抑制作用,发现巨噬细胞/小胶质细胞极化与炎症细胞的激活/浸润与NLRP3炎症小体有关。本研究证明了甲异靛对小鼠CIRI的神经保护作用,解释了它可能通过抑制炎症小体来调节巨噬细胞/小胶质细胞极化,从而发挥神经保护作用,也对CIRI后CNS炎症细胞的激活/浸润有抑制作用。揭示了甲异靛的新药理作用,提示甲异靛有用于治疗脑缺血再灌注损伤或者其它与炎症小体、巨噬细胞/小胶质细胞极化有关疾病的潜力。目的研究甲异靛对小鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用,探究其对小胶质细胞/巨噬细胞极化的调节作用与机制方法1)选用体重为25-30g的C57BL/6小鼠,随机分为5组,分别为Sham组,3个剂量的甲异靛组(4mg/kg、8mg/kg与12mg/kg),MCC950(50mg/kg)组,线栓法制备短暂性大脑中动脉闭塞(transient Middle Cerebral Artery Occlusion,t MCAO)模型,缺血1h后再灌注,在再灌注后立即腹腔内注射给药,术后继续每天在固定时间给药1次。3天后,对小鼠进行神经功能评分,并处死取脑。TTC染色测定脑梗塞范围,测定脑组织含水量,以确定甲异靛与MCC950能否改善脑缺血再灌注损伤和最适有效剂量。2)选择甲异靛8mg/kg作为实验剂量,同时以MCC950(50mg/kg,ip,qd,3d)作比对,应用免疫荧光法(immunofluorescence,IF)观察甲异靛能否影响缺血区小胶质细胞/巨噬细胞的极化、炎症小体的表达、能否抑制炎症细胞的激活/浸润;并提取各组再灌注3天后的脑组织m RNA与蛋白,采用实时定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)对M1相关细胞因子m RNA(TNF-α、IL-1β、i NOS、CD16/32)及M2相关细胞因子m RNA(Ym1/2、CD206、Arg-1)进行检测,采用蛋白免疫印迹法(Western-blot,WB)对TLR4/NF-κB信号通路分子、NLRP3炎症小体复合物组分及相关炎症因子进行检测。利用以上三种实验手段研究甲异靛对脑缺血再灌注损伤后小鼠缺血区炎症反应的影响、对NLRP3炎症小体表达的抑制作用及对小胶质细胞/巨噬细胞极化的调节作用。结果1)应用甲异靛(4mg/kg,8mg/kg,12mg/kg)和MCC950对脑缺血再灌注后3d的小鼠具有神经保护作用。甲异靛和MCC950均可以显著减少t MCAO后脑梗死范围,减轻脑水肿程度,并可改善神经行为学评分,其中8mg/kg是较小最有效剂量,故后续实验中将使用8mg/kg进行给药。2)甲异靛和MCC950均可以抑制小鼠脑缺血再灌注3d后缺血半暗带促进炎症反应的细胞数量,免疫荧光染色结果显示,甲异靛可以显著减少缺血区CD68、i NOS与MPO阳性细胞数量,显著增加Ym1/2阳性细胞数量。3)免疫荧光双染结果显示,NLRP3炎症小体主要表达在神经元和CD68阳性细胞中,其表达量与CD68阳性细胞数量呈正相关关系。4)免疫荧光结果显示,甲异靛和MCC950均可以改善小鼠CIRI后神经元的丢失,抑制NLRP3炎症小体的表达,存活的神经元数量与NLRP3炎症小体表达量之间呈负相关关系。5)甲异靛与MCC950均可以抑制甲异靛组TLR4/NF-κB信号通路分子、NLRP3炎症小体复合物组分及脑缺血相关炎症因子的表达水平。6)甲异靛与MCC950均可以在m RNA水平上抑制M1型巨噬细胞极化相关标志物(i NOS、CD16/32)与炎症因子(TNF-α、IL-1β)的产生,MCC950还可促进M2型巨噬细胞极化标志物(Ym1/2、CD206)m RNA的产生,提示甲异靛可抑制巨噬细胞/小胶质细胞向M1极化,促进向M2极化。结论1)甲异靛通过调节脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞/巨噬细胞极化和炎症细胞的激活/浸润发挥神经保护作用。2)抑制TLR4/NF-κB通路与NLRP3炎症小体可能为甲异靛调节巨噬细胞/小胶质细胞极化与减轻炎症反应的机制。本文主要创新之处在于:1)首先发现甲异靛通过调节脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞/巨噬细胞极化及炎症细胞的激活/浸润发挥神经保护作用。甲异靛可以显著减少小鼠t MCAO后脑梗死范围,减轻脑水肿程度,改善小鼠CIRI导致的神经运动功能障碍及一般状态;抑制CIRI后半暗带巨噬细胞/小胶质细胞向M1极化、促进向M2极化;减少巨噬细胞/小胶质细胞、中性粒细胞的激活/浸润,从而发挥神经保护作用。2)抑制NLRP3炎症小体可能为甲异靛调节巨噬细胞/小胶质细胞极化的机制。MCC950为NLRP3炎症小体特异性抑制剂,通过与其对比,可发现甲异靛在调节巨噬细胞/小胶质细胞极化上与MCC950有相似作用,在实验选取的剂量条件下,甲异靛虽不如MCC950对NLRP3炎症小体的抑制作用显著,但其对小鼠t MCAO后脑缺血再灌注损伤的保护作用比MCC950更明显,提示甲异靛通过抑制NLRP3炎症小体调节巨噬细胞/小胶质细胞极化可能只是发挥神经保护作用的机制之一。