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芋螺多肽(conopeptide)是芋螺分泌的一类用于麻醉猎物的神经毒素肽。根据芋螺多肽高度保守的信号肽序列及二硫键骨架,将芋螺多肽分为A、B1、B2、B3、C、D、E、F、G、H、I1、I2、I3、J、K、L、M、N、O1、O2、O3、P、S、T、V、Y等26个超家族,再根据每个成员保守的半胱氨酸骨架及其药理学作用靶点,进一步可分为α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等亚家族。芋螺多肽结构新颖,多样性高,活性强,选择性高,能区分各种离子通道、受体及亚型,可用于神经药理学分子探针、诊断试剂或直接开发成治疗药物。芋螺多肽Eb1.6属于α-芋螺多肽家族4/7亚家族,含有16个氨基酸,两对二硫键(二硫键连接方式为1-3,2-4),Eb1.6对神经病理性疼痛具有很好的镇痛作用。本课题将通过Realtime PCR和Western blot技术,检测PNL模型大鼠肌肉注射不同剂量的Eb1.6后疼痛相关分子BDNF、NMDA、C-fos、ATF3、GABA、PICK1、AMPA、PKC-Y、GAP-43、NGF-β、TRPV1、TPH1 mRNA 和 BDNF、NGF-β、GABA、AMPA、C-fos、CAMKⅡ-α、CAMKⅡ-β、CAMK-Ⅳ 蛋白表达量的变化,应用生物素标记的Eb1.6通过Far western技术调取靶点分子,并用5-羧基荧光素标记的Eb1.6通过活体及体外荧光标记技术对相关分子进行定位。Con-T[M8Q]为Con-T第8位氨基酸M突变为Q的突变体,属于Conantokins家族芋螺多肽,Conantokins目前已被证明能够特异性的作用于NMDA受体,本实验室前期实验发现,Con-T[M8Q]对小鼠吗啡身体依赖具有很好的抑制活性,为研究其作用机理,初步检测了 Con-T[M8Q]对吗啡依赖小鼠脑组织NMDA受体pNR2B亚基、NR2B亚基、pERK、C-fos、CAMKⅡ-α、CAMKⅡ-β、CAMK-Ⅳ 蛋白表达量及CAMKⅡ-α、CAMKⅡ-β、CAMKⅡ-d、CAMK-Ⅳ、CAMKⅠ-γmRNA 表达量的影响,但检测数据未进行统计学分析,信号通路不够完整,因此本课题将继续实验室前期Con-T[M8Q]的相关工作,对已检测的分子进行数据补充,并进一步检测信号通路中 nNOS、PKC-γ、AMPA、NR2BmRNA 及 nNOS、PKC-γ 蛋白表达量变化情况。以上研究将为Eb1.6及Con-T[M8Q]作用靶点的确定提供依据,为该二肽的进一步应用奠定基础。实验结果显示:(1)相对于生理盐水组,Eb1.6能显著提高BDNF、NGF-β基因表达量,高剂量Eb1.6可升高NMDA基因表达量,高、中剂量可升高ATF3、GAP-43、PICK1基因表达量;Eb 1.6能显著降低AMPA、GABA基因及蛋白的表达量以及CAMKⅡ-β蛋白的表达量;Eb1.6对C-fos基因及蛋白表达量不显著,对PKCγ基因表达量影响及CAMKⅡ-α、CAMK-Ⅳ的蛋白表达量影响不显著。(2)Farwestern实验结果表明,大鼠脑海马组织中存在某一种或几种分子能够与Ebl.6特异性的结合。(3)荧光标记实验表明:小鼠脑组织海马区和大鼠坐骨神经都可能存在能够更加特异的与Ebl.6结合的分子。(4)吗啡依赖小鼠注射不同剂量Con-T[M8Q]后,CAMKⅡ-a、CAMKⅡ-β、CAMKⅣ、NR2B、蛋白和基因表达量均随Con-T[M8Q]剂量增加而降低,Con-T[M8Q]各剂量组相比于对照组Ifenprodil作用效果更加明显。nNOS、PKC-γ基因表达量和C-fos、pERK基因表达量均随Con-T[M8Q]剂量增加而降低,AMPA单体基因表达无明显变化。