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L-精氨酸是一种半必需性氨基酸,具有多种生理功能,如一氧化氮(NO)合成、促进激素分泌和促进伤口愈合等,在食品、医药和动物饲料等方面具有广泛的应用。近年来,随着L-精氨酸需求的增加,利用微生物发酵法生产L-精氨酸越来越得到重视。实验室在前期工作中,通过诱变育种获得一株产L-精氨酸钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5。本论文在实验室前期工作的基础上,对C.crenatum SYPA5-5菌株进行系统途径工程改造,以提高L-精氨酸发酵效率。主要研究结果如下:(1)优化L-谷氨酸到L-精氨酸合成代谢途径。对C.crenatum SYPA5-5(CA0)L-精氨酸合成操纵子进行优化,增强L-谷氨酸到L-精氨酸合成能力。首先,在L-精氨酸合成操纵子阻遏蛋白Arg R编码基因arg R位点整合来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的抗反馈抑制N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)编码基因arg BEc,在敲除arg R基因的同时表达E.coli的NAGK。然后,依次利用延伸因子Tu编码基因eftu启动子Peftu替换操纵子arg CJBDFR和arg GH的启动子Parg C和Parg G,增强L-精氨酸合成基因转录水平,得到菌株CA1。补料分批发酵结果表明,菌株CA1 L-精氨酸产量为45.3 g/L,得率为0.271 g/g,相比CA0菌株的37.5 g/L和0.228 g/g,得到明显提高。(2)增强前体L-谷氨酸供应。通过调控CA1菌株谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶系(ODHC)和丙酮酸羧化酶(PYC)的酶活水平增强前体L-谷氨酸供应。首先,通过在基因组上增加GDH编码基因gdh的拷贝数增强GDH酶活水平,促进α-酮戊二酸合成L-谷氨酸;然后,对odh A基因的核糖体结合位点(RBS)进行优化降低ODHC中E1o亚基的表达量,降低胞内ODHC酶活水平,减少碳流在TCA循环中的消耗;最后,通过将PYC编码基因pyc的起始密码子由GTG变为ATG促进pyc基因的表达,提高胞内PYC酶活水平,增强回补途径,降低TCA循环不畅对细胞生长和L-精氨酸合成的影响,最终得到菌株CA2。补料分批发酵结果表明,CA2菌株的L-精氨酸产量增加至51.6 g/L,得率为0.318 g/g。(3)增加NADPH供应及弱化副产物合成。通过调控CA2菌株中的6-磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、天冬氨酸激酶(AK)和谷氨酸激酶(GK)酶活水平,促进胞内NADPH再生的同时降低副产物的积累。首先,对PGI编码基因pgi的RBS进行优化,不同程度降低胞内PGI酶活水平,增加进入磷酸戊糖途径流量,促进NADPH再生。然后,继续利用RBS优化降低胞内AK酶活水平,降低L-赖氨酸和L-异亮氨酸合成。最后,敲除GK编码基因pro B,阻断L-脯氨酸合成途径,最终得到菌株CA3。补料分批发酵结果表明,CA3菌株的L-精氨酸产量增加至58.1 g/L,得率为0.371 g/g。同时,CA3菌株L-赖氨酸和L-异亮氨酸积累量显著降低,并且无L-脯氨酸积累。(4)产H2O2 NAD(P)H-依赖型黄素还原酶鉴定与功能研究。根据C.glutamicum ATCC13032中cg3223和cg1150的基因序列,扩增出C.crenatum SYPA5-5中的假定黄素还原酶编码基因frd1和frd2并进行序列分析。将frd1和frd2在E.coli BL21中表达并纯化出蛋白产物Frd181和Frd188,对Frd181和Frd188进行酶活鉴定及产H2O2分析,结果表明Frd181和Frd188为产H2O2 NAD(P)H-依赖型黄素还原酶。在CA3菌株中对frd1和frd2基因进行敲除和过表达分析,结果表明敲除frd1和frd2基因,获得菌株CA4,有利于降低细胞H2O2的合成,降低NAD(P)H的无效氧化,进而有利于菌体生长和L-精氨酸合成。补料分批发酵结果表明,CA4菌株的L-精氨酸产量增加至64.2 g/L,菌体量显著增加。(5)增强ATP供给促进L-精氨酸合成研究。首先,在CA4菌株中敲除NADH氧化酶编码基因nox A,减少NADH非产能氧化,为氧化磷酸化提供更多NADH。然后,敲除AMP核苷酶编码基因amn,促进ATP合成,获得菌株CA5。最后,通过过表达磷酸甘油酸激酶(PGK)和丙酮酸激酶(PYK)促进底物水平磷酸化,获得菌株CA5(pyk-pgk)。菌株CA5(pyk-pgk)进行补料分批发酵,L-精氨酸产量增加至71.8 g/L。(6)增强氨同化作用促进L-精氨酸合成研究。首先通过外源添加L-谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸研究氮原子供体添加对CA5菌株L-精氨酸发酵的影响,发现添加L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸能够提高L-精氨酸产量。然后,在CA5菌株中通过过表达自身来源的谷氨酰胺合酶(GS)编码基因gln A和E.coli来源的天冬氨酸酶(APS)编码基因asp A,增加胞内L-谷氨酰胺和L-天冬氨酸合成能力,使得L-精氨酸合成能力得到提高。同时发现随着L-谷氨酰胺和L-精氨酸合成能力的提高,L-谷氨酸合成能力重新成为L-精氨酸合成的限制性因素。最后,通过过量共表达GDH编码基因gdh,最终得到CA6菌株,进一步提高了L-精氨酸产量。菌株CA5和CA6进行补料分批发酵,CA5菌株的L-精氨酸产量为69.5 g/L,CA6菌株的L-精氨酸产量则增加至76.8 g/L。