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目的1.确认正清风痛宁和甲氨蝶呤单用及联用对于RA骨破坏的抑制作用强度；2.从炎症及RANKL系统解释正清风痛宁联合甲氨蝶呤对抗骨破坏的可能机制。方法1.酶消化法进行RA滑膜成纤维细胞原代培养,本实验采用5-10代滑膜成纤维细胞。分为4组并作以下处理：空白对照组,MTX组(浓度0.1mg/ml),正清风痛宁组(浓度0.1mg/ml),联合组(正清风痛宁+MTX,各加浓度0.1mg/ml)。采用苏木精—伊红染色比较不同药物对滑膜成纤维样细胞组织形态学的影响；流式细胞术检测不同药物对滑膜成纤维样细胞凋亡的影响；RT-PCR测定RANKL mRNA的表达。2.建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的SD大鼠关节炎模型,随机分为模型组(生理盐水灌胃)、MTX组(3.8mg/kg/w灌胃)、联合组(正清风痛宁+MTX组,正清风痛宁130mg/kg/d和MTX 3.8mg/kg/w灌胃),另设7只作为正常对照组。采用关节评分法评估关节炎症程度,并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-lα、IL-6、MMP-3, MMP-13的表达水平。结果1.加药组对滑膜细胞组织形态学的改变,光镜下见滑膜细胞出现凋亡表现,形态异常；荧光显微镜下见滑膜细胞出现核质浓集,有明显的凋亡小体。2.加药组对滑膜细胞增殖均有不同程度的抑制作用,流式细胞仪检测结果显示：空白对照组25.3%,MTX组28.4%,正清风痛宁组32.3%,联合组34.7%,说明加药组凋亡细胞百分率均明显高于空白对照组。3.RT-PCR结果显示：各组RANKL电泳条带均较空白组弱；联合组OPG电泳条带较空白组强。相对灰度值计算结果显示,联合组与其余各组相比,其RANKL比值最小,OPG比值最大；MTX组与正清风痛宁组之间比值相似。4.造模后,大鼠关节炎肿胀程度在第21d最为明显,然后逐渐消退,在第35d左右会出现第2个炎症高峰,MTX组和联合组均可减轻关节肿胀,关节炎指数评分在第46d与造模组比较差异有统计学意义(P≤0.05)。5.与模型组比较,MTX组和联合组均可明显抑制大鼠血清IL-1α、IL-6的表达水平,与MTX组相比联合组血清IL-1α、IL-6的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P≤0.05)；MTX组和联合组都可明显抑制血清MMP-3和MMP-13的表达水平,同时联合组血清MMP-3的表达水平低于MTX组,差异有统计学意义(P≤0.05)。6.与模型组比较,MTX组、联合组均提高OPG的表达水平,升高OPG与RANKL的比值；联合组可降低血清RANKL的表达水平,差异有统计学意义(P≤0.05)；联合组与MTX组比较,血清RANKL的表达水平下降更为明显,OPG与RANKL的比值也有显著上升,差异有统计学意义(P≤0.05)。结论1.对体外培养的RA患者成纤维细胞研究发现,正清风痛宁与MTX联合体外给药能够协同促进滑膜成纤维细胞凋亡,并且对RANKL及OPG mRNA的表达有显著影响,说明正清风痛宁联合MTX能够促进滑膜成纤维细胞凋亡,并影响OPG-RANKL系统的平衡调节。2.对CIA大鼠诱导的关节炎模型病变的研究发现,正清风痛宁与MTX联合给药对CIA大鼠关节肿胀有明显的防治效应,能够较好地控制炎症发生发展,可能与其对血清IL-lα、IL-6等炎性因子的抑制作用有关；正清风痛宁与MTX可协同延缓骨破坏的发生,可能与其通过对MMP-3、MMP-13的抑制,以及提高OPG/RANKL的比例有一定关系。