论文部分内容阅读
近年来,由胆道梗阻性肝损伤引起的急性肝损伤和肝纤维化/肝硬化患者日趋增多,严重威胁着人类健康。本文从制备高活性高纯度低内毒素的重组小鼠G-CSF蛋白及重组大鼠sRAGE蛋白入手,经免疫新西兰大白兔及利用抗原亲和纯化,制备具有高特异性的兔抗大鼠RAGE多克隆抗体,以此作为治疗胆道梗阻性肝损伤新蛋白药物的原料,然后采用胆道梗阻性肝损伤动物模型--大鼠胆管结扎（BDL）模型,研究其药效,并从基因角度探究其作用机理,旨在为探索和研究治疗胆道梗阻性肝损伤的新药物提供科学依据。主要研究结果如下:1、选择小鼠G-CSF（mG-CSF）和大鼠sRAGE（rsRAGE）两个蛋白作为候选药物并进行表达纯化。构建了pET-30a（+）-mG-CSF表达质粒并利用大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表达系统获得了高纯度、低内毒素和高生物学活性的G-CSF蛋白,并且发现重组小鼠G-CSF蛋白对肝纤维化的治疗并无显著效果。2、构建了rsRAGE-pPICZαA表达质粒并利用毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）表达系统获得了高产量、高纯度、低内毒素和高生物学活性的重组大鼠sRAGE蛋白。研究还揭示了重组大鼠sRAGE蛋白可显著降低CCl4导致的大鼠肝纤维化。3、通过免疫新西兰大白兔及纯化获取了具有高特异性的兔抗大鼠RAGE多克隆抗体,同时应用大鼠胆管结扎模型,研究了RAGE抗体在胆道梗阻性肝损伤的作用。结果显示RAGE抗体可显著改善大鼠生长和生存状况;同时在对肝脏组织的H&E和MASSON染色中发现该抗体可显著降低胆阻性的肝坏死,炎症,纤维化和胆管增生。血清学指标也发现RAGE抗体可显著改善胆阻引起的肝功能损伤和肝纤维化。4、通过体内体外实验,初步探索了RAGE抗体在胆道梗阻性肝损伤中的作用机理。在体内实验中,采用免疫组化和荧光定量技术发现RAGE抗体可显著抑制炎症因子IL-1β的转录水平以及其在损伤部位的表达,从而降低肝脏坏死/炎症;RAGE抗体可显著地调节MMPs/TIMP-1的表达水平,降低肝纤维化;RAGE抗体还可显著地调节Cyp7α1的表达水平,以降低胆管增生。通过体外LX-2肝星状细胞系实验,证实了RAGE抗体可显著降低Col1α1和MMP-9的表达水平。最后,体内和体外实验同时证实了RAGE抗体可显著降低肝星状细胞的活力。综上研究表明,通过检测和分析各类肝硬化相关基因的表达变化,RAGE抗体对胆道梗阻性肝损伤具有明显的保护作用;同时,体外肝星状细胞实验揭示RAGE抗体的作用机理,是通过显著降低肝星状细胞活力和调节相关基因的表达来降低肝纤维化水平。这些研究结果为进一步开发治疗胆道梗阻性肝损伤新药奠定了基础。