[目的]双链RNA切割对于许多真核和原核RNA的成熟和降解至关重要。RNase Ⅲ家族主要负责这些双链RNA的切割,并且参与双链RNA的加工过程,而RNase Ⅲ正是通过这种方式参与了细胞的多种代谢活动。这个家族主要分为三大类。而卡介苗RNase Ⅲ则属于其中的第一大类。在研究中,我们尝试采用多部纯化的方式来获得可以用于RNA切割反应的高纯度重组酶,并利用双链RNA底物对该重组RNase Ⅲ的生物学特性进行了研究。对于该酶活性的研究,能够帮助我们更好地了解RNase Ⅲ在卡介苗中代谢过程中所发挥的重要作用,从而为解释一些结核杆菌中特有的一些代谢现象提供参考依据。基于卡介苗与人结核杆菌基因组的高度同源性,以及两类菌种中RNase Ⅲ序列的完全匹配性。对卡介苗中RNase Ⅲ的研究,将最终为解决结核杆菌治疗过程中遇到的一系列问题提供新的思路。[方法]利用CTAB-溶菌酶裂解方法,提取卡介苗基因组后,我们将基因组中编码RNase Ⅲ的基因进行PCR扩增,然后将扩增片段克隆至pGEX-5X-1表达载体中。在低温诱导条件下,以一定浓度的IPTG诱导克隆蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌菌株中过表达。利用谷胱甘肽转移酶亲和纯化步骤将重组的RNase Ⅲ从宿主菌的总蛋白裂解物中初步提取重组蛋白,再利用制备性十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺变性凝胶实现重组酶的进一步纯化。电泳分离后,利用电洗脱完成胶块中蛋白的回收,之后再次利用电透析,将电洗脱液中的甘氨酸和SDS进行清除。最后,利用2-甲基-2,4-戊二醇对变性的重组蛋白进行复性。为了测定重组蛋白的RNase Ⅲ活性,我们根据人结核杆菌中16s rRNA和23s rRNA中存在的保守的颈环结构,设计了与之相关的发卡状结构的底物16s[hp]RNA和23s[hp]RNA,并利用RNafold软件分析底物的二级结构。我们利用不同的二价金属离子及不同浓度的二价镁离子研究了二价金属离子对于重组蛋白RNase Ⅲ活性的影响。并利用不同浓度的钠离子,研究了单价离子对于酶活性的影响。[结果]在大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中,经过IPTG诱导可以表达出全长的谷胱甘肽转移酶与卡介苗RNase Ⅲ形成的重组蛋白。经过GST亲和纯化所得到的全长重组酶的纯度可以达到80%左右。经过制备性十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺变性凝胶对亲和纯化产物纯化后,所得到的全长重组酶的纯度可上升至99%。经过2-甲基-2,4-戊二醇对电透析产物进行还原后,重组蛋白显示出了切割双链RNA底物的活性。在双链RNA切割实验中,酶能够将BCG-16S[hp]RNA底物切割成为两个核酸片段,将BCG-23S[hp]RNA切割成为三个核酸片段。重组酶对于这两种底物的切割即依赖于二价金属离子的种类,同时其切割效率又受到单价和双价金属离子浓度的影响。[结论]利用GST亲和纯化与制备性凝胶电泳组合的纯化方法,能够制备出高纯度的卡介苗重组RNase Ⅲ。经过两性的表面活性物质,2-甲基-2,4-戊二醇对纯化后的变性重组酶进行复性后,可以得到有双链RNA切割活性的重组酶。并且在不同的金属离子环境中,重组酶表现出了自身的生物学特征。不同细胞中的RNA代谢途径已经成为当今的研究热点,在真核生物中,RNA干扰现象普遍存在,RNase Ⅲ在其中所发挥作用及其工作机制已经得到广泛研究。但在原核生物中,目前还没有发现典型的RNA干扰机制,RNA代谢主要受到小RNA分子的调控,RNase Ⅲ与其他的一些蛋白元件相互结合,共同参与这种调控。而我们的工作为深入研究卡介苗RNase Ⅲ的生物学特征及其在所参与的代谢过程中所发挥的重要作用奠定了基础。